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O gênero Trypanosoma, ao qual pertence Trypanosoma cruzi, compreende parasitos unicelulares que possuem um único flagelo. Ao longo do ciclo biológico, entre hospedeiros vertebrados e invertebrados, o T. cruzi apresenta as diferentes formas biológicas: epimastigota, tripomastigota e amastigota. O flagelo se apresenta aderido ao corpo celular nas três formas, sendo importante para a morfologia, divisão celular e infectividade do parasito. Este flagelo emerge da bolsa flagelar e é lateralmente aderido ao corpo celular do parasito através da Zona de Adesão Flagelar (FAZ). Sabe-se que a adesão flagelar é mantida pelas proteínas transmembrana FLAs e FLABPs, que interagem por meio de suas porções extracelulares. Apesar da localização de FLABP ser fundamental para o seu funcionamento, não se sabe como esta proteína é direcionada e ancorada na FAZ. Em trabalho prévio do nosso grupo, observou-se uma sequência conservada entre tripanosomatídeos de 12 resíduos de aminoácidos localizada na porção intracelular de FLABP. A hipótese deste trabalho é que essa sequência, chamada de Flagellar Addressing Protein Domain (FD), é importante para a localização de FLABP na FAZ. Desta forma, objetivou-se caracterizar funcionalmente a FLABP e gerar variações, com e sem a sua porção FD, fusionadas à proteína fluorescente GFP, verificando via observação da fluorescência se sua expressão em T. cruzi seria suficiente para direcionar a GFP à FAZ. Para tal, a partir de PCR as 4 variações do gene de FLABP foram copiadas. Estas variações serão clonadas em vetor que já contém a GFP, mas para que suas construções finais sejam endereçadas na célula elas também precisam do peptídeo-sinal de FLABP. Tentamos realizar a ligação do peptídeo-sinal, clonado e digerido com enzimas de restrição, no vetor plasmidial que contém a GFP. Além disso, para caracterizar funcionalmente a FLABP, adotamos a estratégia de deleção do gene via a técnica de Crispr-Cas9. O sistema CRISPR-Cas9 foi utilizado para remover o gene de FLABP em T. cruzi e o substituir por genes de resistência aos antibióticos blasticidina e puromicina. Apenas a linhagem nocaute selecionada pela blasticidina sobreviveu, sendo incorporada ao banco de células do Laboratório de Protozoologia. A eficiência da deleção foi confirmada tanto por PCR quanto por Western blot. Com essa linhagem modificada desenvolvida no projeto, novos experimentos serão realizados para avaliar os efeitos da ausência de FLABP na morfologia, incluindo sua capacidade de multiplicação e de infecção de células hospedeiras. |
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