Nanoemulsão de macela (Achyrocline satureioides): estudo da atividade antimicrobiana in vitro frente a Staphylococcus aureus, mecanismos de ação e potencial como modulador de resistência aos antimicrobianos

Abstract

Uma nova fórmula farmacêutica candidata à terapêutica da mastite bovina, i.e., uma nanoemulsão de macela (Achyrocline satureioides) (NE-ML) (BR 10 2021 008630 0) foi desenvolvida pelo grupo de pesquisa do LABINAT/UFSC. Desse modo, o objetivo deste estudo foi avançar na evolução desta nova tecnologia, investigando in vitro o possível mecanismo de ação antimicrobiana, o efeito antimicrobiano ao longo do tempo em diferentes condições do meio e a capacidade de interação com antimicrobianos comerciais. Para isso, a atividade antimicrobiana da NE-ML foi investigada usando diferentes metodologias, incluindo microdiluição em caldo e ensaio time-kill. A avaliação de condutividade elétrica relativa e a quantificação de materiais absorventes a 260 e 280 nm, bem como ensaios de interação com antimicrobianos também foram realizados. As concentrações inibitórias mínimas (CIM) da NE-ML contra a cepa padrão S. aureus ATCC 25923 foram determinadas em pH 7,4, 6,0 e 5,0, sendo 5% (v/v) em pH 7,4 e 6,0, e 2,5% (v/v) em pH 5,0. Este resultado foi evidenciado com o modelo sigmoidal, que mostrou que uma menor concentração de NE-ML em pH 5,0 foi capaz de levar a diminuição de 50% da redução populacional máxima, quando comparada com as concentrações necessárias para o mesmo efeito de extermínio em pH 7,4 e 6,0. A condutividade elétrica relativa da solução bacteriana aumentou após a exposição à NE-ML em concentrações de 1 CIM e 2 CIM. O aumento da absorbância em 260 nm e 280 nm foi observado nas suspensões bacterianas expostas à NE-ML, não havendo diferença entre 2 e 4 h de exposição (p>0,05). O conteúdo de proteínas totais também aumentou (p<0,05) com o tempo de exposição à NE-ML. As micrografias das bactérias tratadas com NE-ML mostraram alterações na membrana plasmática e na parede celular, incluindo invaginações e áreas eletrotransparentes na região central do citosol. Com o aumento da concentração, a área eletrotransparente da região citosólica aumentou e aglomerados amorfos eletrodensos surgiram no citosol, com algumas áreas da membrana plasmática sem definição. Também ocorreu a alteração no padrão de divisão celular. A NE-ML apresentou ação na membrana plasmástica, levando a alterações na permeabilização e integridade da ultraestrutura, se entendendo para parede celular, e também foram verificados danos no citoplasma celular. Além disso, o aumento da concentração da NE-ML resultou em danos mais extensos, como demonstrado pela inibição do crescimento bacteriano nos ensaios time-kill em pH 7,4 e 5,0. A modelagem matemática confirmou a atividade antimicrobiana da NE-ML em ambientes intracelulares acidificados. No entanto, quando combinada com antimicrobianos beta-lactâmicos a NE-ML apresentou interações indiferentes, indicando que sua utilização em combinação com esses compostos não é justificada. Quando em combinação com o antimicrobiano aminoglicosídeo gentamicina, apresentou resultado promissor com uma potencial interação sinérgica/aditiva contra um dos isolados bacterianos em estudo, sendo um achado importante e que necessita de maiores investigações. Os resultados encontrados nesta pesquisa são achados importantes no desenvolvimento do grau de maturidade tecnológica dessa nova fórmula farmacêutica candidata ao tratamento da mastite bovina, especialmente em sistemas de produção sustentáveis.

Abstract: A new pharmaceutical formula candidate for the therapy of bovine mastitis, i.e., macela-nanoemulsion (Achyrocline satureioides) (NE-ML) (BR 10 2021 008630 0), was developed by the LABINAT/UFSC research group. Therefore, the objective of this study was to advance the evolution of this new technology, investigating in vitro the possible mechanism of antimicrobial action, the antimicrobial effect over time in different environmental conditions and the ability to interact with commercial antimicrobials. For this purpose, the antimicrobial activity of NE-ML was investigated using different methodologies, including broth microdilution and time-kill assay. The minimum inhibitory concentrations (MIC) of NE-ML against the standard strain S. aureus ATCC 25923 were determined at pH 7.4, 6.0 and 5.0, being 5% (v/v) at pH 7.4 and 6.0, and 2.5% (v/v) at pH 5.0. This result was evidenced with the sigmoidal model, which showed that a lower concentration of NE-ML at pH 5.0 was able to lead to a 50% decrease in the maximum population reduction, when compared to the concentrations necessary for the same extermination effect at pH 7.4 and 6.0. The relative electrical conductivity of the bacterial solution increased after exposure to NE-ML at 1 MIC and 2 MIC concentrations. Increased absorbance at 260 nm and 280 nm was observed in bacterial suspensions exposed to NE-ML, with no difference between 2 and 4 hours of exposure (p>0.05). The total protein content also increased (p<0.05) with the exposure time to NE-ML. Micrographs of bacteria treated with NE-ML showed alterations in the plasma membrane and cell wall, including invaginations and electrotransparent areas in the central region of the cytosol. With increasing concentration, the electrotransparent area of the cytosolic region increased, and amorphous electrodense clusters appeared in the cytosol, with some areas of the plasma membrane being ill-defined. There was also a change in the pattern of cell division. NE-ML showed action in the plasmatic membrane, modifying the permeability and integrity of its ultrastructure, expanding the damage to cell wall and cytoplasm. Moreover, the increase NE-ML concentration resulted in more extensive damage, as demonstrated by the bacterial growth inhibition in time-kill assay at pH 7.0 and 5.0. Mathematical modeling confirmed the antimicrobial activity of NE-ML in acidified intracellular environments. However, when combined with beta-lactam antimicrobial, NE-ML showed indifferent interactions, indicating that its use in combination with these compounds is not justified. When combined with aminoglycoside antimicrobial, as gentamicin, it showed promising results with potential synergic/additive interaction against one of the studied bacterial isolates, being an important discovery that needs more investigation. The results found in this research are important in the development of the technological maturity level of this new pharmaceutical formula candidate for the therapy of bovine mastitis, especially in sustainable production systems.