Ácido palmítico modula a função mitocondrial e viabilidade em linhagem celular de astrócitos

Abstract

O crescente aumento do excesso de peso, obesidade e doenças metabólicas associadas possuem como causa principal o aumento da ingestão de alimentos com elevados teores em gorduras saturadas e/ou carboidratos, juntamente ao aumento de comportamentos sedentários. O consumo de dietas hipercalóricas por si só induz ao processo inflamatório que pode estar associado à disfunção dos processos homeostáticos de regulação energética e metabólica e assim, contribuir para o desenvolvimento da obesidade e de doenças metabólicas. A obesidade é definida como acúmulo anormal de tecido adiposo e é caracterizada como um estado de inflamação crônica de baixo grau, que pode comprometer a função neuronal, estando associada a doenças neurodegenerativas, declínio cognitivo e demência. Na obesidade, ocorre aumento na circulação de ácidos graxos saturados livres (como o palmitato) vindos do consumo excessivo destes na dieta e também do aumento da lipólise do tecido adiposo em razão da resistência à insulina (comorbidade associada) e aumento de mediadores pró-inflamatórios circulantes, podendo alterar o metabolismo e função mitocondrial. Os astrócitos são células essenciais para a manutenção da homeostasia do sistema nervoso central (SNC). A localização privilegiada dessas células na barreira hematoencefálica faz com que os astrócitos sejam potenciais alvos das elevadas concentrações de ácidos graxos em casos de obesidade. Vários estudos demonstram que o consumo de dietas hiperlipídicas e ácidos graxos saturados promovem disfunção mitocondrial no SNC, no entanto estes estudos tem focado sobretudo em células neuronais. Deste modo, a hipótese deste trabalho foi de que os ácidos graxos saturados induzem um estado pro-inflamatório causando alterações na função mitocondrial e estresse oxidativo, o que contribui para a alteração da função e viabilidade de astrócitos em um modelo in vitro. Para testar a nossa hipótese foi utilizado um modelo in vitro de uma linhagem celular de astrócito (células C6), que receberam tratamento com 200 µM de palmitato ou 200 µM de estearato durante 6 horas. Após as 6 horas, avaliamos a viabilidade celular utilizando o ensaio de MTT e a morfologia dos astrócitos através de uma imunocitoquímica de fluorescência usando o marcador GFAP. Também, avaliamos a expressão gênica de citocinas pró-inflamatórias por RT-PCR. Para as avaliações mitocondriais, foi avaliado potencial de membrana mitocondrial por JC-1 e Mitotracker Deep Red, atividade enzimática dos complexos mitocondriais e expressão gênica de genes envolvidos na fisiologia mitocondrial. A respiração celular foi mensurada por respirometria de alta resolução. Para avaliação de estresse oxidativo utilizamos a sonda DCF-DA e ensaio de TBARS. Observamos que os tratamentos acima de 400 µM de palmitato durante 6 horas e 24 horas diminuíram a viabilidade celular comparado ao controle, deste modo para os experimentos seguintes utilizamos os tratamentos com as concentrações de 200 µM de palmitato ou 200 µM de estearato, para ver o efeito do tratamento antes da diminuição da viabilidade. O tratamento com 200 µM de palmitato alterou a morfologia dos astrócitos, aumentou a expressão de marcadores pró-inflamatórios (IL-6 e TNF-?), diminuiu o potencial de membrana mitocondrial, diminuiu a atividade do complexo I mitocondrial, diminuiu a expressão gênica de mitofusina-2 e diminuiu a expressão gênica de citrato sintase, sugerindo uma disfunção mitocondrial. Entretanto não houve alteração no consumo de oxigênio mitocondrial, nem nos parâmetros de estresse oxidativo (DCF-DA e TBARS). O tratamento com estearato não causou alterações significativas em nenhum parâmetro avaliado. Em conclusão, o palmitato induz um processo inflamatório e prejudica função mitocondrial em modelo de cultura celular de astrócitos, levando a mudança de morfologia e diminuição da viabilidade nestas células.

Abstract: The main cause of the increase of excess weight, obesity and associated metabolic diseases is the increase in the food intake with high levels of saturated fats and/or carbohydrates, associated with an increase in sedentary behaviors. The consumption of high-calorie diets induces an inflammatory process that may be associated with the dysregulation of physiological processes of energy homeostasis and metabolic regulation and thus contribute to the development of obesity and metabolic diseases. Obesity is defined as abnormal accumulation of adipose tissue and is characterized as a state of chronic low-grade inflammation, that can compromise neuronal function. Obesity is associated with cognitive decline and dementia. In obesity occurs an increase in the circulating levels of saturated fatty acids, such as palmitate, and also an increase in the pro-inflammatory mediator?s. The high levels of fatty acids in circulation results from the consumption of high fatty diets as well as the increases in adipose tissue lipolysis (resulted from insulin resistance, an associated comorbidity). The high levels of saturated fatty acids and pro-inflammatory mediators can change the metabolism and mitochondrial function, compromising mitochondrial redox balance. Astrocytes are essential cells for maintaining homeostasis in the central nervous system, contributing to neuronal functioning. The privileged location of these cells in the blood-brain barrier makes astrocytes potential targets for high concentrations of fatty acids in cases of obesity. Several studies demonstrate that the consumption of high-fat diets and saturated fatty acids promote mitochondrial dysfunction in the CNS, The hypothesis of this work was that saturated fatty acids cause induces an inflammatory process that can change mitochondrial function and increases in oxidative stress, leading to morphological changes and decreases in cellular viability in an in vitro model of astrocytes. A cell line culture of C6 (astrocytes) was used, which received treatment with 200 µM palmitate or 200 µM stearate for 6 hours. After 6 hours, we evaluated cell viability using the MTT assay and the astrocyte?s morphology by immunocytochemistry using GFAP marker. We also evaluated the gene expression of cytokines by RT-PCR. For mitochondrial assessments, mitochondrial membrane potential was measured by the probes JC-1 and Mitotracker deep Red, enzymatic activity of mitochondria?s complexes, gene expression of proteins related to mitochondrial physiology. Mitochondrial respiration was evaluated by oximetry by high-resolution respirometry. DCF-DA and TBARS assay were used to determine oxidative stress. We observed that 6 hours and 24 hours of palmitate treatment above 400 µM decreased cell viability. For the next experiments 200 µM of palmitate or 200 µM stearate were used to treat the cells to visualize their effect before the decrease in viability. The treatment with 200 µM palmitate for 6 hours altered astrocyte morphology, increased gene expression of pro-inflammatory cytokines (IL-6 and TNF-?), decreased mitochondrial membrane potential, decreased mitochondrial complex I activity, decreased gene expression of mitofusin-2 and citrate synthase, suggesting that palmitate induces mitochondrial dysfunction. However, there was no change in mitochondrial oxygen consumption, nor in the oxidative stress parameters. Stearate treatment for 6h did not cause significant changes in any parameter evaluated. In conclusion, palmitate induces inflammation and impairs mitochondrial function in astrocytes, leading to changes in morphology and decreased viability in these cells