Caracterização de enzimas de biotransformação de fase I em tartaruga Chelonia mydas (Linnaeus, 1758): foco em biomonitoramento ambiental

Abstract

A tartaruga-verde (Chelonia mydas) é sensível à ação antrópica, sendo afetada negativamente por contaminantes ambientais. Os contaminantes podem causar alterações nos diversos níveis de organização biológica nos organismos, podendo comprometer o funcionamento do ecossistema. A capacidade inata dos organismos em alterar o metabolismo, fisiologia e comportamento para manter a homeostase frente às mudanças ambientais naturais ou antropogênicas pode ser usada como biomarcadores de contaminação aquática em programas de biomonitoramento ambiental. Nesses programas, é comum medir uma bateria de biomarcadores moleculares, bioquímicos e citogenéticos para avaliar os efeitos dos xenobióticos. As enzimas da fase I de biotransformação de xenobióticos, como os citocromos P450 (CYP1, CYP2 e CYP3) são normalmente utilizadas como biomarcadores bioquímicos. No entanto, frequentemente os programas de biomonitoramento carecem de metodologias adequadas para medir a resposta dos biomarcadores e de um modo eficaz de traduzir a linguagem técnica e científica em uma linguagem acessível para informar a sociedade, órgãos ambientais e agências de controle e fiscalização. Desse modo, o objetivo deste estudo foi caracterizar as atividades catalíticas dos citocromos P450 em tecido hepático de C. mydas, por meio de ensaios cinéticos com éteres de resorufina e de análises in silico, e propor dois índices de Resposta Integrada de Biomarcadores (IBRs) baseados no IBR e IBRv2, normalmente utilizados para integrar os dados de biomarcadores¬¬. Os resultados sugerem que as atividades 7-etóxi-resorufina O-deetilase (EROD) e 7-metoxi-resorufina O-demetilase (MROD) são mediadas por CYPs cataliticamente similares ao CYP1A1 e CYP1A2 de mamíferos ou CYP1A4 e CYP1A5 de aves, respectivamente. A atividade 7-Benziloxi-resorufina O-debenzilase (BROD) parece envolver atividade similar ao CYP3A de mamíferos. As atividades EROD, MROD e BROD foram otimizadas e podem ser utilizadas em programas de biomonitoramento ambiental para avaliar a indução ou inibição da atividade enzimática dos CYPs. Por meio de metodologias in silico, foram produzidos os modelos tridimensionais do CYP1A, CYP1A5 e CYP1B1 de C. mydas, mas as análises de similaridade da estrutura da proteína, colinearidade de blocos sintênicos e atracamento molecular indicam que CYP1A e CYP1A5 devem ser renomeados como CYP1A5 e CYP1A4, respectivamente. Também foi possível aprimorar os índices IBR e IBRv2, permitindo a manutenção da variabilidade de dados e seu posterior uso em análises estatísticas. Os novos índices IBRi, IBRv2i e IBRv2i ponderado correlacionaram-se com os índices originais IBR e IBRv2 e foram capazes de detectar diferenças entre grupos experimentais em um biomonitoramento simulado computacionalmente e em um estudo de caso realizado em laboratório. O presente estudo mostrou a possibilidade do uso de metodologias não invasivas in vitro e in silico em C. mydas e padronizou a metodologia de quantificação das atividades EROD, MROD e BROD, sugerindo os prováveis CYP1 que catalisam essas reações. Por fim, foram criados os índices IBRi e IBRv2i, que mantêm a variabilidade dos dados dos grupos experimentais e podem ser analisados usando estatística paramétrica ou não paramétrica como qualquer outro parâmetro. Além disso, essa abordagem ajuda a traduzir a terminologia técnico-científica em uma linguagem mais acessível, adequada para órgãos governamentais relacionados à gestão do meio ambiente.

Abstract: The green turtle (Chelonia mydas) is sensitive to anthropogenic actions, being negatively affected by environmental contaminants. These contaminants can cause alterations at various levels of biological organization within organisms, potentially compromising ecosystem functioning. The innate capacity of organisms to alter metabolism, physiology, and behavior to maintain homeostasis in response to natural or anthropogenic environmental changes can be used as biomarkers of aquatic contamination in environmental biomonitoring programs. In these programs, it is common to measure a battery of molecular, biochemical, and cytogenetic biomarkers to assess the effects of xenobiotics. Phase I xenobiotic biotransformation enzymes, such as cytochromes P450 (CYP1, CYP2, and CYP3), are typically used as biochemical biomarkers. However, biomonitoring programs often lack adequate methodologies to measure biomarker responses and an effective way to translate the technical language of science into accessible language to inform society, environmental governmental agencies, and regulatory agencies. Thus, the objective of this study was to standardize the catalytic activities of cytochromes P450 in liver tissue of C. mydas using resorufin ethers, characterize the interactions of C. mydas CYP1 with substrates and the inhibitor ANF through in silico methodology, and propose two Integrated Biomarker Response indices based on IBR and IBRv2, commonly used to integrate biomarker data. The results suggest that EROD and MROD activities are mediated by CYPs catalytically similar to mammalian CYP1A1 and CYP1A2 or avian CYP1A4 and CYP1A5, respectively. BROD activity appears to involve an activity similar to mammalian CYP3A. EROD, MROD, and BROD activities were optimized and can be used in environmental biomonitoring programs to evaluate the induction or inhibition of CYP enzymatic activity. Through in silico methodologies, the three-dimensional models of CYP1A, CYP1A5, and CYP1B1 were produced, but the protein structure similarity, syntenic block collinearity, and molecular docking analyses indicate that CYP1A and CYP1A5 should be renamed CYP1A5 and CYP1A4, respectively. Additionally, the IBR and IBRv2 indices were improved, allowing the preservation of data variability for their subsequent use in statistical analyses. The new indices, IBRi, IBRv2i, and weighted IBRv2i, correlated with the original IBR and IBRv2 indices and were able to detect differences between experimental groups in a computationally simulated biomonitoring and in a laboratory case study. The present study demonstrated the possibility of using non-invasive in vitro and in silico methodologies in C. mydas and standardized the methodology for quantifying EROD, MROD, and BROD activities, suggesting the probable CYP1 enzymes catalyzing these reactions using computational protein homology modeling and molecular docking techniques. Finally, the IBRi and IBRv2i indices were created, which maintain the variability of data from experimental groups and can be analyzed using parametric or non-parametric statistics like any other parameter. Furthermore, this approach helps to translate technical-scientific terminology into a more accessible language, suitable for governmental agencies related to environmental management.