Impactos da infecção pelo vírus Zika sobre o controle molecular e aspectos morfológicos do desenvolvimento inicial de estruturas derivadas do prosencéfalo

Abstract

A infecção materna pelo vírus Zika (ZIKV) durante a gestação está associada a um conjunto de condições clínicas em recém-nascidos conhecido como síndrome congênita do vírus Zika (SCZ). As manifestações clínicas apresentadas por pacientes com a SCZ incluem, dentre outras, microcefalia, calcificações no tecido cerebral, ventriculomegalia e anomalias oftalmológicas. Os mecanismos subjacentes a estes efeitos abrangentes da infecção pelo ZIKV sobre o desenvolvimento craniofacial, além do córtex cerebral, ainda não são totalmente compreendidos. O objetivo deste trabalho foi investigar os impactos da infecção pelo ZIKV sobre vias moleculares e aspectos morfológicos relacionados à padronização e ao desenvolvimento do prosencéfalo e estruturas derivadas. O estudo foi realizado com embriões de Gallus gallus com três dias de idade, para as análises de expressão gênica, e com cinco dias de idade, para as análises morfológicas. Em ambos os casos, ovos fertilizados de G. gallus foram inoculados com uma solução contendo ZIKV próximo à região cefálica no segundo dia de desenvolvimento. Os embriões foram coletados 24 h ou 72 h depois da inoculação, conforme o grupo experimental. O RNA total dos embriões de três dias foi extraído para as análises de quantificação viral e de expressão gênica, ambas por RT-qPCR. Os embriões com cinco dias tiveram suas cabeças isoladas e fixadas. O RNA total do corpo dos embriões de cinco dias foi usado para quantificar a carga viral individual. As análises computacionais de interações intergênicas e interproteicas foram realizadas com as plataformas GeneMANIA e STRING Database. As análises estatísticas foram realizadas por meio do R e do RStudio. A exposição ao ZIKV em embriões de três dias de idade reduziu a expressão de genes relacionados à padronização e ao desenvolvimento do prosencéfalo, como SIX3, LHX2, NR2E1, HES1, CER1 e NEUROG2. A razão entre a largura e o comprimento do telencéfalo foi impactada e aspectos morfológicos do telencéfalo, do diencéfalo e dos olhos foram correlacionados negativamente à carga viral individual em embriões de cinco dias. Observou-se também que a infecção pelo ZIKV impactou o crescimento do neuroepitélio subpalial ao longo do eixo ântero-posterior. Análises de correlação entre os dados de expressão gênica de embriões de três dias indicaram que a infecção pelo ZIKV pode desequilibrar a dinâmica das interações entre os genes envolvidos no desenvolvimento craniofacial. Adicionalmente, investigações computacionais de interações gênicas e proteicas revelaram possíveis alvos moleculares do ZIKV, potencialmente relacionados aos impactos morfológicos observados no desenvolvimento de estruturas derivadas do prosencéfalo. Conjuntamente, estes resultados sugerem que a infecção pelo ZIKV interfere em vias moleculares integradas que atuam desde muito cedo no desenvolvimento do sistema nervoso central, o que poderia explicar a multiplicidade de alterações no desenvolvimento craniofacial apresentada por pacientes com SCZ.

Abstract: Maternal infection by Zika virus (ZIKV) during pregnancy is associated with a set of clinical conditions in newborns known as congenital Zika syndrome (CZS). Clinical manifestations observed in patients with CZS include, among others, microcephaly, brain tissue calcifications, ventriculomegaly, and ophthalmologic anomalies. The underlying mechanisms of these broad effects of ZIKV infection on craniofacial development, beyond the cerebral cortex, are not yet fully understood. The objective of this study was to investigate the impacts of ZIKV infection on molecular pathways and morphological aspects related to the patterning and development of the prosencephalon and derived structures. The study was conducted using three-day-old Gallus gallus embryos for gene expression analyses and five-day-old embryos for morphological analyses. In both cases, fertilized eggs of G. gallus were inoculated with a solution containing ZIKV near the cephalic region on the second day of development. The embryos were collected 24 h or 72 h after inoculation, depending on the experimental group. Total RNA from three-day-old embryos was extracted for viral quantification and gene expression analyses, both by RT-qPCR. Five-day-old embryos had their heads isolated and fixed. Total RNA from the bodies of five-day-old embryos was used to quantify individual viral load. Computational analyses of intergenic and interprotein interactions were performed using the GeneMANIA and STRING Database platforms. Statistical analyses were conducted with R and RStudio. Exposure to ZIKV in three-day-old embryos reduced the expression of genes related to forebrain patterning and development, like SIX3, LHX2, NR2E1, HES1, CER1, and NEUROG2. The ratio between width and length of the telencephalon was affected, and morphological aspects of the telencephalon, diencephalon, and eyes were negatively correlated with individual viral load in five-day-old embryos. It was also observed that ZIKV infection impacted the growth of the subpallial neuroepithelium along the anteroposterior axis. Correlation analyses between gene expression data from three-day-old embryos indicated that ZIKV infection may disrupt the dynamics of interactions among genes involved in craniofacial development. Additionally, computational investigations of gene and protein interactions revealed possible molecular targets of ZIKV, potentially related to the morphological impacts observed in the development of forebrain-derived structures. Taken together, these results suggest that ZIKV infection interferes with integrated molecular pathways that act very early in the development of the central nervous system, which could explain the multiplicity of alterations in craniofacial development presented by patients with SCZ.