Avaliação da resistência ao congelamento e identificação de bactérias do solo da Geleira Collins, Antártica.

Abstract

Os microrganismos na Antártica estão sujeitos a frequentes ciclos de congelamento e descongelamento. Existem microrganismos capazes de sobreviver a esses ciclos, conferindo resistência a essas condições. O objetivo deste estudo foi isolar, identificar molecularmente e caracterizar a resistência ao congelamento de bactérias da Antártica. Amostras de solo foram coletadas a 0, 25 e 50 metros à frente da Geleira Collins, localizada na Ilha Rei George, Península Antártica. O isolamento consistiu na suspensão dos solos e inoculação em meio R2A a 6 ºC até o surgimento de colônias. A seleção dos isolados foi baseada em sua morfologia. Foram isoladas 15 bactérias. Em relação a caracterização morfológica, pelo método de coloração de Gram, 11 bactérias foram caracterizadas como Gram-positivas e 4 como Gram-negativas. Além disso, as bactérias foram classificadas quanto a pigmentação das colônias, onde 7 isolados apresentaram coloração amarela, 6 branca e 3 laranja. A análise de BOX-PCR revelou 4 filotipos distintos entre os isolados, demonstrando diversidade de bactérias isoladas. Após a BOX-PCR, foi realizada a identificação molecular dos isolados pela região RNAr 16S, com 14 isolados bacterianos, classificados nos gêneros Arthrobacter, Psychrobacter, Leifsonia, Brevundimonas, Microterricola e Rhodococcus. Foi realizada uma pré-seleção de isolados para resistência ao congelamento. Para isso, os isolados foram submetidos a 1 ciclo de congelamento de 24 horas a -6 ºC e descongelamento a 25 ºC por 30 minutos. A contagem de unidades formadoras de colônia foi realizada a partir da comparação de diluições seriadas até 10-6, antes e depois do congelamento, apresentando a taxa de sobrevivência de cada isolado aos ciclos. Foram selecionadas 9 bactérias com sobrevivência igual ou acima de 50% ao congelamento. Os microrganismos pré-selecionados foram submetidos a 4 ciclos de congelamento de 24 horas a -18 ºC seguido pelo descongelamento a 25 ºC por 30 minutos. Os resultados mostraram porcentagens de sobrevivência alta após o primeiro ciclo para os isolados Microterricola sp. PSC02 (89,91%), Psychrobacter sp. PSC25.3 (88,00%), Leifsonia sp. PSC503 (82,58%) e Brevundimonas sp.PSC50.4 (81,37%). Os demais apresentaram porcentagens de sobrevivência baixa após o primeiro ciclo para PSC50.1 (48,93%), Leifsonia sp. PSC01 (45,31%), Arthrobacter sp. PSC25.4 (44,57%), Arthrobacter sp. PSC50.9 (41,46%) e Arthrobacter sp. PSC50.5 (29,70%). O isolado Microterricola sp. PSC02 permaneceu com a mesma concentração de células após os 4 ciclos de congelamento. Os resultados mostraram que o terceiro ciclo é um ponto crítico para a manutenção da viabilidade celular dos microrganismos, mostrando uma baixa significativa na concentração de células bacterianas. Os resultados obtidos neste estudo demonstram que bactérias isoladas da Antártica são resistentes ao congelamento. Além disso, existe uma diversidade de gêneros resistentes e não resistentes ao congelamento, por conta de diferentes mecanismos de adaptação como pigmentos, enzimas adaptadas ao frio, fluidez da membrana plasmática e produção de substâncias crioprotetoras que incluem os exopolissacarídeos, proteínas anticongelantes (AFPs) e proteínas nucleantes de congelamento (INPs). Mais estudos precisam ser realizados para elucidar e caracterizar os mecanismos de adaptação ao frio das bactérias antárticas.

Microorganisms in Antarctica are exposed to frequent freeze-thaw cycles. Some of them are capable of surviving these cycles, providing resistance to these conditions. The aim of this study was to isolate, molecularly identify and characterize the freeze resistance of Antarctic bacteria. Soil samples were collected 0 meters, 25 meters and 50 meters in front of Collins Glacier, located on King George Island, Antarctic Peninsula. Isolation consisted of soil suspension and inoculation in R2A medium at 6 ºC until colonies appeared. The isolates selection was based on their morphology. 15 bacteria were isolated. Regarding morphological characterization, using the Gram staining method, 11 bacteria were characterized as Gram-positive and 4 as Gram-negative. Furthermore, the bacteria were classified according to the pigmentation of the colonies, where 7 isolates were yellow, 6 white and 3 orange. BOX-PCR analysis revealed 4 distinct phylotypes among the isolates, demonstrating isolated bacteria diversity. After BOX-PCR, the isolates were molecularly identified using the 16S rRNA region, with 14 bacterial isolates categorized into the genera Arthrobacter, Psychrobacter, Leifsonia, Brevundimonas, Microterricola and Rhodococcus. Pre-select of isolates on the basis of freezing resistance was conducted. In order to achieve this, the isolates underwent one cycle of freezing at -6 ºC for 24 hours and thawing for 30 minutes at 25 ºC. Colony-forming units were counted by comparing serial dilutions up to 10-6, prior to and following freezing, demonstrating the survival rate of each isolate throughout the cycles. Nine bacteria that exhibited a 50% or higher survival rate after freezing were selected. The pre-selected microorganisms underwent four cycles of freezing at -18 ºC for 24 hours and thawing for 30 minutes at 25 ºC. High survival rates following the first cycle have been demonstrated by the results for Microterricola sp. PSC02 (89.91%), Psychrobacter sp. PSC25.3 (88.00%), Leifsonia sp. PSC503 (82.58%) and Brevundimonas sp. PSC50.4 (81.37%). After the first cycle, the survival rates for PSC50.1 (48.93%), Leifsonia sp. PSC01 (45.31%), Arthrobacter sp. PSC25.4 (44.57%), Arthrobacter sp. PSC50.9 (41.46%), and Arthrobacter sp. PSC50.5 (29.70%) were lower than those of the other species. After four freezing cycles, the isolated Microterricola sp. PSC02 cell concentration remained unchanged. The results demonstrated that the third cycle is a critical point for microorganisms, exhibiting a substantial decrease in the concentration of bacterial cells. The results obtained in this study indicate that bacteria isolated from Antarctica are resistant to freezing.. Furthermore, a variety of adaptation mechanisms, such as pigments, cold-adapted enzymes, plasma membrane fluidity, and the synthesis of cryoprotective substances such as exopolysaccharides, antifreeze proteins (AFPs), and freezing nucleating proteins (INPs), have led to a diversity of resistant and non-freezing resistant genera. To clarify and better comprehend Antarctic bacteria's mechanisms for adapting to the cold, more research is required.