Caracterização dos domínios de ligação ao DNA dos receptores nucleares de Crassostrea gigas e a regulação da transcrição de genes de citocromos P450: um estudo in silico

Abstract

A poluição de ambientes aquáticos vem sofrendo um contínuo aumento ao longo dos anos, decorrente principalmente de atividades humanas. A ostra do Pacífico, Crassostrea gigas, é uma das espécies mais utilizadas para o estudo dos impactos de contaminantes no ambiente marinho e na saúde humana. Os receptores nucleares (NRs) são proteínas pertencentes a uma superfamília de fatores de transcrição que se ligam ao DNA e são promissores biomarcadores moleculares para o monitoramento desses contaminantes. No genoma de C. gigas é possível identificar a presença de 43 NRs. No entanto, pouco se conhece sobre a funcionalidade e o papel fisiológico desses NRs. Neste estudo, focamos no domínio de ligação ao DNA (DBD) dos NRs. Essa região é responsável por interagir com regiões específicas do DNA, sendo uma etapa chave para os NRs regularem a expressão transcricional. A análise de como os DBDs dos NRs interagem com a molécula de DNA pode gerar informações importantes sobre sua funcionalidade e os possíveis genes alvos, além de elucidar os papeis fisiológicos dos NRs de C. gigas ainda pouco conhecidos. Neste estudo, utilizamos abordagens in silico para o estudo estrutural dos DBDs dos NRs e sua interação com moléculas de DNA. Inicialmente, investigamos a relação do receptor CgNR5A com as proteínas de citocromo P450 (CYP). Receptores homólogos encontrados em vertebrados regulam a expressão de CYPs envolvidas em vias endógenas de esteroides, ausentes em C. gigas. Diante disso, investigamos a possibilidade de CgNR5A regular CYPs com diferentes papéis fisiológicos. Através de uma análise estrutural e funcional do DBD de CgNR5A, identificamos uma interação monomérica com elementos de resposta (REs) estendidos. Esses REs foram encontrados em 30 genes de CYPs de C. gigas pertencentes a famílias conhecidas por seu envolvimento no metabolismo de xenobióticos e lipídeos. Além disso, propusemos uma possível relação CgNR5A-CgDAX, uma vez que o RE de CgNR5A foi encontrado na região promotora do NR CgDAX. Numa segunda etapa, investigamos a estrutura e funcionalidade do DBD dos NRs de C. gigas. Identificamos que os DBDs dos NRs de C. gigas adotam três principais conformações estruturais. Essas conformações, juntamente com as poses de interação DBD-DNA elaboradas, apontaram para possíveis modos de atuação dimérica e monomérica dos NRs. As interações DBD-DNA foram submetidas a simulações de dinâmica molecular (MD) para avaliação da estabilidade dos complexos, indicando o potencial funcional dos NRs de C. gigas. Foi possível discriminar modos de interação com o DNA que reproduziram as estruturas de vertebrados conhecidas experimentalmente. Isso sugere que certos modos de ligação ao DNA e tipos de REs podem ser conservados entre vertebrados e C. gigas, permitindo extrapolar possíveis modos de atuação e sequências REs. Na terceira etapa deste estudo, desenvolvemos métodos in silico para a identificação de sequências alvos dos NRs ainda desconhecidos. Utilizando o campo de forças Martini 3.0, elaboramos uma abordagem metodológica promissora para a quantificação da interação DBD-DNA. Demonstramos, através de simulações de MD, que o NR SF-1 apresentou maior afinidade por moléculas de DNA contendo seu RE alvo quando comparado a outras sequências de DNA. Isso evidencia o promissor uso do Martini 3.0 para a avaliação da interação proteína-DNA e a busca por REs dos NRs. Portanto, este estudo apresenta avanços no entendimento da funcionalidade dos NRs de C. gigas, trazendo detalhes estruturais dos modos de interação com o DNA e possíveis papeis fisiológicos. Além disso, apresentamos aqui novas abordagens metodológicas que poderão ser aplicadas em estudos de biologia molecular, particularmente no campo da ecotoxicologia.

Abstract: The pollution of aquatic environments has been continuously increasing over the years, mainly due to human activities. The Pacific oyster, Crassostrea gigas, is one of the most commonly used species for studying the impacts of contaminants on the marine environment and human health. Nuclear receptors (NRs) are proteins that belong to a superfamily of DNA-binding transcription factors and are promising molecular biomarkers for monitoring these contaminants. In the genome of C. gigas, it is possible to identify the presence of 43 NRs. However, little is known about the functionality and physiological role of these NRs. This study focuses on the DNA-binding domain (DBD) of these NRs. This region is responsible for interacting with specific regions of DNA, a key step for NRs to regulate transcriptional expression and their target genes. Analyzing how the DBDs of NRs interact with the DNA molecule can provide information about their functionality and possible target genes, as well as shed light on the physiological roles of C. gigas NRs that are still unknown. In this study, we used in silico approaches to investigate the structural characteristics of the NRs' DBDs and their interaction with DNA molecules. Initially, we investigated the relationship between the CgNR5A receptor and cytochrome P450 (CYP) proteins. Homologous receptors found in vertebrates regulate the expression of CYPs involved in endogenous steroid pathways, which are absent in C. gigas. Therefore, we investigated the possibility that CgNR5A regulates CYPs with different physiological roles. Through a structural and functional analysis of the CgNR5A DBD, we identified a monomeric interaction with extended response elements (REs). These REs were identified in 30 CYP genes of C. gigas that belong to families known for their involvement in xenobiotic and lipid metabolism. Additionally, we proposed a possible CgNR5A-CgDAX relationship, as the CgNR5A RE was found in the promoter region of CgDAX. In the second phase of this study, we investigated the structure and functionality of the DBDs of C. gigas NRs. We identified that the DBDs of C. gigas NRs adopt three main structural conformations. These conformations, along with the elaborated DBD-DNA interaction poses, pointed to possible dimeric and monomeric modes of action of the NRs. Furthermore, the DBD-DNA interactions were subjected to molecular dynamics (MD) simulations and remained complexed over time, indicating the functional potential of C. gigas NRs. We were able to discern DNA interaction modes that reproduced experimentally known vertebrate structures. This suggests that certain DNA-binding modes and types of REs may be conserved between vertebrates and C. gigas, allowing for the extrapolation of possible modes of action and REs for C. gigas NRs. In the third phase of this study, we developed in silico methods to identify target sequences of yet unknown NRs. Using the Martini 3.0 force field, we developed a promising methodological approach to quantify the DBD-DNA interaction. Through MD simulations, we demonstrated that the NR SF-1 showed higher affinity for DNA molecules containing its target RE compared to other DNA sequences. This highlights the promising use of Martini 3.0 for assessing protein-DNA interaction and searching for REs of NRs. Therefore, this study significantly advances our understanding of C. gigas NRs, providing insights into their functionality, DNA interaction and potential physiologic roles. Also, develop new methodological approaches that can be applied in future studies of molecular biology and ecotoxicology.