Characterization of bacteria and yeasts from the antarctic peninsula aiming at the biotechnological application of antifreeze proteins

Abstract

A Antártica é um dos ambientes mais inóspitos do planeta, caracterizado por temperaturas extremamente baixas, limitação de água líquida e escassez de nutrientes. Para sobreviver nessas condições, microrganismos antárticos desenvolveram adaptações específicas, como a produção de proteínas anticongelantes (AFPs), que inibem a formação de cristais de gelo e protegem as células contra os danos do congelamento. Devido a essas propriedades, as AFPs despertam grande interesse biotecnológico, com aplicações potenciais em saúde, indústria e agricultura, especialmente em criopreservação e estabilização de biomoléculas. Este estudo teve como objetivo identificar e caracterizar microrganismos antárticos produtores de AFPs, avaliando seu potencial na criopreservação celular e na estabilidade de adenovírus recombinantes. Entre os objetivos específicos, destacam-se a criação de um banco de microrganismos produtores de AFPs, testes de resistência ao congelamento a -18 °C e -80 °C, análise da atividade de inibição de recristalização de gelo, caracterização molecular e estrutural dos microrganismos resistentes ao congelamento e avaliação da eficácia de extratos proteicos na preservação celular e estabilidade viral. Para alcançar esses objetivos, foram aplicadas várias técnicas analíticas: (1) uma revisão sobre microrganismos produtores de AFPs em regiões polares; (2) isolamento e identificação de microrganismos a partir de amostras antárticas utilizando sequenciamento molecular (ITS e RNAr 16S), seguido de testes de resistência ao congelamento a -18 °C e análise da atividade de inibição de recristalização em extratos proteicos; (3) 21 isolados foram submetidos ao teste de resistência a -80 °C e caracterização morfológica, sendo quatro selecionados para estudo aprofundado: Rhodotorula sp. C01, Pedobacter sp. BGS4005, Psychrobacter sp. P61 e Salinibacterium sp. P45. Proteínas intracelulares e extracelulares desses microrganismos foram testadas para criopreservação de células E. coli e HEK293, e em ensaios de estabilidade de adenovírus recombinantes monitorados ao longo de 60 dias. Os resultados mostram que ambientes polares possuem uma diversidade de 172 microrganismos produtores de AFPs, destacando a importância desses ecossistemas como fontes de organismos adaptados ao frio. Ao todo, foram isolados 215 microrganismos, dos quais 118 foram identificados molecularmente. Destes, 24 demonstraram resistência ao congelamento a -18 °C e 14 exibiram atividade de inibição de recristalização, com quatro apresentando ambas as características. No teste a -80 °C, Psychrobacter sp. P53 manteve viabilidade celular após o congelamento, sendo considerado altamente resistente. Nos ensaios de criopreservação, extratos extracelulares de Pedobacter sp. e Psychrobacter sp. conferiram viabilidades de 5% e 4%, respectivamente, em E. coli, enquanto a AFP tipo III proporcionou 10%. Em células HEK293, extratos intracelulares apresentaram eficácia semelhante ao DMSO (10-15%), enquanto a AFP tipo III alcançou 50%. Na preservação de adenovírus, o extrato de Psychrobacter sp. P61 e a AFP tipo III mantiveram a estabilidade viral após 60 dias. Conclui-se que microrganismos antárticos representam fontes promissoras de AFPs, com significativo potencial biotecnológico para criopreservação celular e estabilidade viral, reforçando o papel da Antártica como um reservatório natural de inovação biotecnológica.

Abstract : Antarctica is one of the most inhospitable environments on the planet, characterized by extremely low temperatures, limited liquid water, and nutrient scarcity. To survive in such extreme conditions, Antarctic microorganisms have developed specific adaptations, such as producing antifreeze proteins (AFPs), which inhibit ice crystal formation and protect cells from freezing damage. Due to these properties, AFPs have attracted significant biotechnological interest, with potential applications in health, industry, and agriculture, particularly in cryopreservation and biomolecule stabilization. This study aimed to identify and characterize Antarctic microorganisms that produce AFPs, assessing their potential in cellular cryopreservation and the stability of recombinant adenoviruses. Among the specific objectives were the creation of a microbial database of AFP producers, conducting freeze-resistance tests at -18 °C and -80 °C, analyzing ice recrystallization inhibition activity, molecular and structural characterization of freeze-resistant microorganisms, and evaluating the efficacy of protein extracts in cellular preservation and viral stability. To achieve these objectives, several analytical techniques were applied: (1) a comprehensive review of AFP-producing microorganisms in polar regions; (2) isolation and identification of microorganisms from Antarctic samples using molecular sequencing (ITS and 16S rRNA), followed by freeze-resistance tests at -18 °C and analysis of ice recrystallization inhibition in protein extracts; (3) twenty-one isolates were subjected to resistance tests at -80 °C and morphological characterization, with four selected for further study: Rhodotorula sp. C01, Pedobacter sp. BGS4005, Psychrobacter sp. P61, and Salinibacterium sp. P45. The intracellular and extracellular proteins from these microorganisms were tested in cryopreservation assays on E. coli and HEK293 cells, as well as in recombinant adenovirus stability assays monitored over 60 days. The results show that polar environments contain a diversity of 172 AFP-producing microorganisms, highlighting the importance of these ecosystems as sources of cold-adapted organisms. A total of 215 microorganisms were isolated, of which 118 were molecularly identified. Of these, 24 demonstrated freeze resistance at -18 °C, and 14 exhibited ice recrystallization inhibition activity, with four displaying both characteristics. In the -80 °C test, Psychrobacter sp. P53 maintained cell viability after freezing, considered a highly resistant strain. In cryopreservation assays, extracellular extracts from Pedobacter sp. and Psychrobacter sp. conferred viabilities of 5% and 4%, respectively, in E. coli, while Type III AFP provided 10%. In HEK293 cells, intracellular extracts showed similar efficacy to DMSO (10-15%), while Type III AFP reached 50%. In adenovirus preservation, the extract from Psychrobacter sp. P61 and Type III AFP maintained viral stability after 60 days. In conclusion, Antarctic microorganisms represent promising sources of AFPs, with significant biotechnological potential for cellular cryopreservation and viral stability, reinforcing Antarctica's role as a natural reservoir for biotechnological innovation.