Atividade catalítica e imunodetecção de isoformas de citocromo P450 hepáticas em toninhas, Pontoporia blainvillei (Gervais e D'Orbigny, 1844) e botos-cinza, Sotalia guianensis (Van Bénéden, 1864)

Abstract

Apesar da proibição e/ou restrição no uso de diversos poluentes como bifenilas policlorados (BPC) e Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPA), muitos ainda estão presentes no ambiente, podendo ser detectados inclusive em cetáceos. Esses xenobióticos podem ser bioacumuláveis, causar efeitos tóxicos e estão associados ao mecanismo de indução de proteínas dos complexos citocromos P450 (CYPs), enzimas importantes das vias de fase I de biotransformação de xenobióticos. Por este motivo, os CYPs têm sido utilizados como importantes biomarcadores de exposição a estes compostos. Biomarcadores podem sinalizar precocemente impactos aos cetáceos e seu uso em programas de biomonitoramento pode auxiliar na preservação de espécies, como a toninha, Pontoporia blainvillei, e o boto-cinza, Sotalia guianensis. A toninha é o cetáceo mais ameaçado de extinção do Atlântico Sudoeste e o boto-cinza, encontra-se perto de ser ameaçado. As duas espécies são frequentemente capturadas acidentalmente em redes de pesca e são ameaçadas pela degradação de seu ambiente natural. O presente estudo visou avaliar a atividade e as propriedades cinéticas de enzimas citocromo P450, através da avaliação das atividades Alcóxi-resorufina O-deetilases (AROD) (metóxi, MROD, benzilóxi, BROD e etóxi, EROD), bem como a expressão de CYP1A em P. blainvillei e S. guianensis analisada por western blotting nos microssomas obtidos de amostras hepáticas. As atividades MROD, BROD e EROD foram detectadas em ambas as espécies e dentre as atividades mensuradas apenas BROD apresentou variação intraespecífica, sendo maior em machos de S. guianensis em comparação com fêmeas da mesma espécie. As medianas das atividades AROD apresentaram diferenças significativas entre as espécies, mostrando maior relevância de MROD e EROD em P. blainvillei e EROD em S. guianensis. Os ensaios com os inibidores elipticina e cetoconazol nas atividades BROD e EROD em S. guianensis apresentaram inibição de 100% em baixas concentrações, sugerindo prevalências de isoformas de CYP1A e CYP3A. Em P. blainvillei há a sugestão de participação de outras isoformas. A expressão de CYP1A variou de ausente até 5,2 unidades arbitrárias de CYP1A (UA) em S. guianensis e de 0,01 UA a 0,44 UA em P. blainvillei. em que também apresentou diferença significativa entre jovens e adultos, sendo maior em adultos. As atividades MROD, BROD e níveis de expressão de CYP1A1 apresentaram diferenças significativas entre as espécies. As análises de correlação foram significativamente positivas para as atividades AROD em ambas as espécies bem como o comprimento dos indivíduos de S. guianensis com os níveis de BPC e o comprimento dos indivíduos de P. blainvillei com a expressão de CYP1A além de haver correlação negativa significativa entre os níveis de HPA e atividades BROD e EROD em S. guianensis. Não foram observadas correlações positivas significativas entre as quantidades de HPA e BPC e as atividades de AROD ou as expressões de CYP1A neste estudo. Entretanto, a variação dos resultados entre indivíduos e espécies pode ser relevante para futuras análises e comparações em necrópsias hepáticas dos organismos investigados. Essa variação pode auxiliar na identificação de potenciais biomarcadores e ser importante para o biomonitoramento e a conservação de seus habitats.

Abstract: Despite the prohibition and/or restriction on the use of various pollutants such as polychlorinated biphenyls (PCB) and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH), many are still present in the environment and can even be detected in cetaceans. These xenobiotics can be bioaccumulative and cause toxic effects, and they are associated with the mechanism of inducing proteins of the cytochrome P450 (CYPs) complexes, which are important enzymes in the phase I biotransformation pathways of xenobiotics. For this reason, CYPs have been used as important biomarkers for exposure to these compounds. Biomarkers can signal early impacts on cetaceans, and their use in biomonitoring programs can assist in the preservation of species such as the franciscana dolphin (Pontoporia blainvillei) and the gray dolphin (Sotalia guianensis). The franciscana dolphin is the most endangered cetacean in the Southwest Atlantic, while the gray dolphin is nearing threatened status. Both species are frequently caught accidentally in fishing nets and are threatened by the degradation of their natural habitats. This study aimed to evaluate the activity and kinetic properties of cytochrome P450 enzymes by assessing the activities of alkoxyresorufin O-deethylases (AROD) (methoxy, MROD, benzyloxy, BROD, and ethoxy, EROD), as well as the expression of CYP1A in P. blainvillei and S. guianensis, analyzed by western blotting in microsomes obtained from liver samples. MROD, BROD, and EROD activities were detected in both species, and among the measured activities, only BROD showed intra-specific variation, being higher in males of S. guianensis compared to females of the same species. The median AROD activities showed significant differences between species, with greater relevance of MROD and EROD in P. blainvillei and EROD in S. guianensis. Assays with the inhibitors ellipticine and ketoconazole on BROD and EROD activities in S. guianensis showed 100% inhibition at low concentrations, suggesting the prevalence of CYP1A and CYP3A isoforms. In P. blainvillei, there is a suggestion of the involvement of other isoforms. The expression of CYP1A varied from absent to 5.2 arbitrary units of CYP1A (AU) in S. guianensis and from 0.01 AU to 0.44 AU in P. blainvillei, with a significant difference also observed between juveniles and adults, being higher in adults. MROD and BROD activities and CYP1A1 expression levels showed significant differences between the species. Correlation analyses were significant positive for AROD activities in both species, as well as the length of S. guianensis individuals with PCB levels and the length of P. blainvillei individuals with CYP1A expression, in addition to a significant negative correlation between PAH levels and BROD and EROD activities in S. guianensis. No significant positive correlations were observed between the amounts of PAH and PCB and AROD activities or CYP1A expressions in this study. However, the variation of results between individuals and species may be relevant for future analyses and comparisons in hepatic necropsies of the investigated organisms. This variation may aid in the identification of potential biomarkers and be important for biomonitoring and the conservation of their habitats.