Toxicidade do piriproxifeno sobre o desenvolvimento do encéfalo e do crânio: impactos moleculares, celulares e teciduais

Abstract

O piriproxifeno (PPF) é utilizado no controle de organismos que impactam na agricultura e, como medida de saúde pública, é adicionado à água potável para combater vetores de arboviroses, como a dengue. Apesar da aprovação desse uso, surgiram preocupações sobre os potenciais efeitos do PPF no sistema nervoso central, especialmente após o aumento dos casos de microcefalia em recém-nascidos no Brasil, levantando debates sobre sua segurança. Em resposta, pesquisas mais recentes começaram a indicar que a exposição ao PPF pode resultar em neurotoxicidade. Entretanto, os eventos celulares e as vias de acesso ao sistema nervoso central ainda não são bem compreendidos. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a toxicidade do piriproxifeno sobre a morfologia do tecido neural e a integridade da barreira hematoencefálica (BHE), durante o desenvolvimento do encéfalo, bem como no processo de ossificação do crânio, utilizando embriões de Gallus domesticus, como modelo experimental. Neste estudo, foram avaliadas as concentrações subletais 0,01 mg/L e 10 mg/L de PPF diluídas em solução veículo contendo DMSO e salina a 0,9%. No grupo controle, os embriões foram expostos apenas com a solução veículo. A exposição dos embriões ocorreu uma única vez no primeiro dia embrionário (E1), e a avaliação foi realizada no décimo dia embrionário (E10). Para investigar os efeitos desta exposição, foram realizadas análises histológicas, histoquímicas, imuno-histoquímicas e moleculares. Os resultados obtidos foram organizados em três capítulos apresentados nesta tese. Os dados apresentados no primeiro capítulo, revelaram que o PPF causou alterações ultraestruturais significativas, como a redução de cílios e microvilosidades em células ependimárias, além de danos em mitocôndrias, retículo endoplasmático, corpos de Golgi e membranas celulares nas demais células neurais. O PPF reduziu a transcrição de fox3 e vim, importantes para a diferenciação de neurônios e glia, respectivamente, e diminuiu a proteína NeuN, relacionada a neurônios maduros. O processo de ossificação do crânio também foi afetado, com aumento na área ossificada e diminuição no espaçamento entre ossos. Os dados apresentados no segundo capítulo, revelaram que a exposição ampliou a área e o número de capilares sanguíneos, elevando o nível de fatores angiogênicos como VEGF e VCAM-1, e comprometeu a integridade da BHE ao reduzir pericitos e a proteína de adesão N-caderina. Danos às junções estreitas, à rede mitocondrial e ao retículo endoplasmático, bem como autofagia, foram observados em células endoteliais que compõem a BHE. Os dados apresentados no terceiro capítulo, demonstraram aumento no dano ao DNA, alterações na proliferação celular, aumento de apoptose e redução na diferenciação e migração neural em embriões com exencefalia. Também foi observado aumento no dano ao DNA, e diminuição na proliferação e migração celular nos embriões sem exencefalia. Além disso, os danos celulares foram semelhantes no cérebro anterior e médio, ocorrendo mesmo com a morfologia externa normal dos embriões. De modo geral, os danos ao tecido neural provavelmente estão associados aos danos observados na BHE, uma vez que os capilares sanguíneos são potenciais vias de acesso do PPF. Essas alterações, juntamente com a aceleração da ossificação craniana, comprometem o crescimento e desenvolvimento do encéfalo, eventos fortemente associados a origem de microcefalia.

Abstract: Pyriproxyfen (PPF) is used to control organisms that impact agriculture and, as a public health measure, is added to drinking water to combat vectors of arboviruses such as dengue. Despite the approval of this use, concerns have been raised about the potential effects of PPF on the central nervous system, especially after the increase in cases of microcephaly in newborns in Brazil, raising debates about its safety. In response, more recent research has begun to indicate that exposure to PPF may result in neurotoxicity. However, the cellular events and pathways to the central nervous system are still not well understood. This study aimed to characterize the toxicity of pyriproxyfen on neural tissue morphology and blood-brain barrier (BBB) integrity, during brain development, as well as in the process of skull ossification, using Gallus domesticus embryos as an experimental model. In this study, sublethal concentrations of 0.01 mg/L and 10 mg/L of PPF diluted in a vehicle solution containing DMSO and 0.9% saline were evaluated. In the control group, the embryos were exposed only to the vehicle solution. Exposure of the embryos occurred once on the first embryonic day (E1), and the evaluation was conducted on the tenth embryonic day (E10). To investigate the effects of this exposure, histological, histochemical, immunohistochemical, and molecular analyses were conducted. The results obtained were organized into three chapters presented in this thesis. The data presented in the first chapter revealed that the PPF caused significant ultrastructural alterations, such as the reduction of cilia and microvilli in ependymal cells, as well as damage to mitochondria, the endoplasmic reticulum, the Golgi apparatus, and cellular membranes in other neural cells. PPF reduced the transcription of fox3 and vim, important for the differentiation of neurons and glia, respectively, and decreased the NeuN protein, associated with mature neurons. The process of skull ossification was also affected, showing an increase in the ossified area and a decrease in inter-bone spacing. The data presented in the second chapter revealed that the exposure increased the area and number of blood capillaries, increasing the level of angiogenic factors such as VEGF and VCAM-1, and compromised the integrity of the BBB by reducing pericytes and the adhesion protein N-cadherin. Damage to tight junctions, the mitochondrial network, and the endoplasmic reticulum, as well as autophagy, was observed in endothelial cells that make up the BBB. The data presented in the third chapter demonstrated an increase in DNA damage, changes in cell proliferation, increased apoptosis, and a reduction in neural differentiation and migration in embryos with exencephaly. An increase in DNA damage and a decrease in cell proliferation and migration were also observed in embryos without exencephaly. Additionally, the cellular damage was similar in the anterior and midbrain, occurring even with the normal external morphology of the embryos. Overall, damage to neural tissue is likely associated with the damage observed in the BBB, as blood capillaries are potential pathways for PPF access. These changes, along with the acceleration of cranial ossification, impair the growth and development of the brain, events strongly associated with the origin of microcephaly.