Production of high-purity ascorbic acid-nicotinamide cocrystals by high-pressure technology: optimization, polymorphism control, and biological potential

Abstract

A vitamina C (ácido L-ascórbico, ASC) é um potente nutriente com propriedade antioxidante e diversas funções metabólicas, propriedades regenerativas e potencial anticâncer que pode formar cocristais com a amida da vitamina B3 (nicotinamida, NIC), de forma a estabilizar a vitamina C tornando-a mais funcional. Métodos de cocristalização via fluidos supercríticos como o dióxido de carbono (CO2) podem modular as propriedades físico-químicas dessas vitaminas. Este estudo explorou a cocristalização de ASC e NIC pela rota não convencional a alta pressão por meio do método empregando CO2 como antissolvente gasoso (GAS) e etanol como solvente. A técnica GAS (90 bar, 45 °C) demonstrou produzir preferencialmente o polimorfo 1:1 (ASC:NIC) Forma I, causando uma mudança substancial na morfologia e tamanho dos cocristais comparado aos compostos puros e sua mistura física, determinados por MEV. Os resultados obtidos por PXRD, DSC e FITR confirmaram a formação dos cocristais comparando com a técnica convencional de maceração assistida por líquido (LAG). Os cocristais apresentaram uma atividade antioxidante melhorada em pH ácido (13,9-16,1 µg·mL-1) comparado à vitamina C pura (28,7-33,9 µg·mL-1), embora não haja sinergismo com a NIC. Um método para a precisa quantificação da fase cocristalina produzida via GAS foi adaptada por meio de espectrofotometria derivativa de primeira ordem (FODS), cujos resultados foram validados por LC-MS com alta precisão. Por meio de balanço de massa nas bateladas do GAS, o método FODS forneceu resultados para a pureza dos cocristais de ASC-NIC. Um design experimental do tipo Box-Behnken com metodologia de superfície de resposta foi aplicado visando otimizar os parâmetros operacionais do GAS (temperatura, fluxo de CO2 e razão molar inicial ASC:NIC) em termos da pureza, rendimento e tamanho dos cocristais obtidos. Cocristais (1:1) de alta pureza (32-100%) foram produzidos sob diversas condições, com rendimentos variáveis (36-69%) tendo a razão molar inicial dos compostos o fator mais significativo dentre os estudados para as respostas avaliadas. Um excesso de ASC na solução inicial afeta negativamente a pureza, enquanto excesso de NIC favorece o cocristal 1:1 puro, resultados que foram confirmados por HPLC e análise elementar. Além disso, interações significantes (p<0.05) entre os efeitos estudados foram observados para as três respostas. Os cocristais obtidos por GAS também apresentaram um alto índice de cristalinidade (>0.9), tamanho reduzido (4-13 µm), e morfologia controlada, preservando a atividade antioxidante da vitamina C com melhores estabilidade à luz e calor. Não obstante, os cocristais não apresentaram citotoxicidade (viabilidade celular > 80%) em concentrações de até 500 µmol·L-1 contra células endoteliais de veia umbilical humana (Huvec), mostrando potencial para aplicações biomédicas e farmacêuticas. A técnica GAS com CO2 e etanol demonstrou ser uma alternativa adequada e sustentável para a funcionalização da vitamina C por meio da cocristalização com nicotinamida.

Abstract: Vitamin C (L-ascorbic acid, ASC) is a powerful antioxidant nutrient with diverse metabolic functions, regenerative properties, and anticancer potential that can form cocrystals with the amide derivative of vitamin B3, nicotinamide (NIC), stabilizing it and making vitamin C more functional. Cocrystallization methods involving supercritical fluids such as carbon dioxide (CO2) can greatly modulate the physicochemical properties of these vitamins. This study explored the cocrystallization of ASC and NIC by a non-conventional high-pressure route through the gas antisolvent (GAS) technique with CO2 and ethanol as the solvent. GAS (90 bar, 45 °C) was shown to produce the common 1:1 preferentially (ASC:NIC) Form I polymorph of the cocrystal, providing a great morphology change and size reduction compared to pure compounds and physical mixtures (PM), assessed by SEM. Complementary screenings using liquid-assisted grinding (LAG) supported the findings of PXRD, DSC, and FTIR analyses. The cocrystals demonstrated enhanced antioxidant activity (AA) in acidic pH, with lower IC50 values in the DPPH assay (13.9-16.1 µg·mL-1) compared to pure vitamin C (28.7-33.9 µg·mL-1). However, no synergistic effect with NIC was observed. A method for precisely quantifying the cocrystal phase produced by GAS was adapted using first-order derivate spectrophotometry (FODS). LC-MS confirmed the results, and the method was validated with high precision. By applying a mass balance to GAS batches, the results of the FODS method provided the purity and yield of ASC-NIC cocrystals produced by GAS. Moreover, a Box-Behnken experimental design with surface response methodology could successfully optimize the GAS operational parameters (temperature, CO2 flow rate, and ASC to NIC molar ratio) regarding the purity, yield, and particle length. High-purity 1:1 ASC cocrystals (37.2-100.2%) were produced under various conditions with variable yields (36.1-68.7%), with the initial molar ratio of ASC to NIC playing a crucial role in determining final cocrystal purity. Excess ASC led to decreased cocrystal purity, while excess NIC favored the formation of the 1:1 cocrystal. HPLC and elemental analysis further corroborated the varying degrees of cocrystal purity. In addition, significant (p<0.05) interaction effects of studied variables were also observed. The GAS-produced cocrystals exhibited a high crystallinity index (>0.9), reduced particle size (x-x µm), and controlled morphology, retaining the antioxidant activity of ASC and showing enhanced photo- and thermal stability. Moreover, the cocrystals obtained by GAS and LAG did not present cytotoxicity (cell viability> 80%) up to a 500 µmol·L-1 concentration in human umbilical vein endothelial (Huvec) cells, showing promise in biomedical or pharmaceutical applications. GAS with CO2/ethanol demonstrated a suitable and sustainable process for functionality enhancement of vitamin C by cocrystallization with nicotinamide.