Identificação dos determinantes de resistência e tipificação molecular por sequenciamento de genoma completo em isolados de Neisseria gonorrhoeae não sensíveis à azitromicina coletados no Brasil entre 2015 e 2023

Abstract

Introdução: Neisseria gonorrhoeae (gonococo), um diplococo Gram-negativo, é responsável por causar cerca de 374 milhões de infecções por ano. Essa bactéria coloniza as mucosas humanas e pode causar uretrite em homens e cervicite em mulheres. O tratamento incorreto pode levar à ascensão da bactéria ao trato genital superior e causar Doença Inflamatória Pélvica, gravidez ectópica e esterilidade. O diagnóstico da gonorreia em homens é baseado principalmente nos sintomas clássicos que derivam da uretrite aguda. Nas mulheres, os sintomas inespecíficos dificultam o diagnóstico. Já foram descritas cepas de gonococo com resistência a todos as classes de antimicrobianos usadas no tratamento, inclusive às cefalosporinas de terceira geração (ceftriaxona e cefixima) e aos macrolídeos (azitromicina), recomendadas atualmente pela Organização Mundial da Saúde. Os mecanismos de resistência aos macrolídeos são diversos, e incluem mutações no gene que codifica o sítio de ação da azitromicina, o RNA ribossomal 23S, e mutações nos genes que controlam a expressão da bomba de efluxo MtrCDE. O sequenciamento do genoma completo possibilita mapear os determinantes de resistência em uma cepa/isolado ou em uma população de bactérias e auxilia na descoberta de novos determinantes. Objetivos: Identificar as linhagens dos isolados de Neisseria gonorrhoeae não sensíveis a azitromicina através dos métodos NG-MAST, NG-STAR E MLST; Correlacionar as linhagens identificadas com as linhagens relacionadas a resistência à azitromicina já descritas na literatura; caracterizar os determinantes moleculares de resistência à azitromicina através de sequenciamento de genoma completo. Metodologia: Foram selecionados 34 isolados de N. gonorrhoeae provenientes de amostras de secreção uretral masculina, 1 isolado de orofaringe e um isolado retal, com concentração inibitória mínima = 2 µg/mL para azitromicina (isolados não sensíveis). Estes isolados foram identificados por biologia molecular através da amplificação do rRNA 16S e do gene da proteína PorA e pelo equipamento Vitek® 2 (bioMérieux) e depois foram submetidos ao sequenciamento de genoma completo. Os dados brutos dos genomas obtidos foram tratados para melhorar a qualidade de leitura das sequências e em seguida analisados através de softwares de bioinformática e bancos de dados de resistência. Resultados: Neste estudo, 32 dos 36 isolados com diminuição de sensibilidade à azitromicina carregam a mutação C2611T, 9 carregam mutação no gene repressor da bomba de efluxo MtrCDE, o mtrR, 23 carregam uma mutação no gene promotor do mtrR e 2 carregam um mosaico de N. meningitidis no gene promotor da bomba de efluxo. A linhagem 1901 do esquema de tipagem MLST foi a mais prevalente nesses isolados, e a linhagem 1025 foi a mais prevalente na tipagem pelo NG-STAR. Muitos isolados tipados pelo NG-MAST não tiveram uma linhagem designada, mas a mais prevalente foi a linhagem 16495. Conclusão: A infecção gonocócica é um problema de saúde pública e, através da compreensão do comportamento dos isolados circulantes no Brasil, este estudo pode auxiliar na adoção de estratégias de manejo e tratamento.

Abstract: Introduction: Neisseria gonorrhoeae (gonococcus), a Gram-negative diplococcus, is responsible for approximately 374 million infections annually. This bacterium colonizes human mucosal surfaces and can cause urethritis in men and cervicitis in women. Improper treatment can lead to the ascent of the bacterium to the upper genital tract, causing pelvic inflammatory disease, ectopic pregnancy, and infertility. The diagnosis of gonorrhea in men is primarily based on the classic symptoms of acute urethritis. In women, nonspecific symptoms make diagnosis difficult. Strains of gonococci with resistance to all classes of antimicrobials used in treatment, including third-generation cephalosporins (ceftriaxone and cefixime) and macrolides (azithromycin), currently recommended by the World Health Organization, have already been described. Mechanisms of resistance to macrolides are diverse and include mutations in the gene encoding the azithromycin binding site, 23S ribosomal RNA, and mutations in genes controlling the expression of the MtrCDE efflux pump. Whole-genome sequencing enables the mapping of resistance determinants in a strain/isolate or in a population of bacteria and aids in the discovery of new determinants. Objectives: To identify the lineages of Neisseria gonorrhoeae isolates that are not susceptible to azithromycin using the NG-MAST, NG-STAR, and MLST methods; to correlate the identified lineages with those previously described in the literature as related to azithromycin resistance; and to characterize the molecular determinants of azithromycin resistance through whole genome sequencing. Methodology: Thirty-four N. gonorrhoeae isolates were selected from samples of male urethral secretion, one isolate from the oropharynx, and one isolate from the rectum, all with a minimum inhibitory concentration (MIC) = 2 µg/mL for azithromycin (non-susceptible isolates). These isolates were identified by molecular biology techniques through amplification of the 16S rRNA and PorA protein genes, and by the Vitek® 2 system (bioMérieux), and then subjected to whole genome sequencing. The raw genome data obtained were processed to improve the quality of the sequence reads and subsequently analyzed using bioinformatics software and resistance databases. Results: In this study, 32 of the 36 isolates with reduced susceptibility to azithromycin carry the C2611T mutation, 9 carry a mutation in the mtrR gene, the repressor of the MtrCDE efflux pump, 23 carry a mutation in the mtrR promoter gene, and 2 carry an N. meningitidis mosaic in the efflux pump promoter gene. Lineage 1901 of the MLST typing scheme was the most prevalent in these isolates, and lineage 1025 was the most prevalent in NG-STAR typing. Many isolates typed by NG-MAST did not have a designated ST, but lineage 16495 was the most prevalent. Gonococcal infection is a public health problem, and by understanding the behavior of circulating isolates in Brazil, this study can help in the adoption of management and treatment strategies.