Desenvolvimento de nanocarreadores de ß-cariofileno para o tratamento de ceratite amebiana

Abstract

A ceratite amebiana é uma doença rara causada pela Acanthamoeba spp. que acomete, com maior frequência, indivíduos imunocomprometidos e usuários de lentes de contato. A inespecificidade de ação de vários fármacos somada a existência de formas resistentes do protozoário exige o uso de altas doses destes e um maior tempo de tratamento, o que aumenta as chances de ocorrência de efeitos adversos. Frente a isto, produtos naturais tais como óleos essenciais ou seus compostos isolados têm sido investigados como candidatos antiAcanthamoeba. Assim, uma revisão da literatura foi inicialmente realizada para identificar óleos essenciais promissores não só do ponto de vista da atividade citada, mas com outros efeitos secundários que contribuiriam para melhorar o quadro da doença (ex.: ação antiinflamatória, cicatrizante). Tendo em vista que o ß-cariofileno, um composto majoritário de vários óleos essenciais, tem se destacado devido a seu efeito anti-inflamatório, tanto que é encontrado em preparações comerciais, sua atividade anti-Acanthamoeba foi explorada de maneira inovadora neste novo estudo. Como este terpeno é suscetível a oxidação, apresenta baixa solubilidade aquosa e alta volatilidade, sua incorporação em nanocarreadores foi considerada. Nanoemulsões aniônicas (Phosal® 50+) e catiônicas (brometo de cetrimônio) foram preparadas por emulsificação espontânea, demonstrando tamanho (<265 nm) e PdI (<0.2) reduzidos. Nanopartículas poliméricas (NPs) com tripolifosfato de sódio (TPP) e quitosana de baixo ou médio peso molecular foram também preparadas. Um tamanho reduzido (203-240 nm), alta carga superficial (entre +15 e 18 mV) e baixo PdI (próximo a 0.3) foram encontrados para estas partículas mediante ajustes na quantidade de TPP. Nanoemulsões (NEs) aniônicas e NPs armazenadas a 4 e 25 °C mostraram ser estáveis até 60 e 90 dias, respectivamente, enquanto as nanoemulsões catiônicas foram estáveis por 180 dias nestas condições. O ß-cariofileno, na concentração de 200 µM, inibiu o crescimento de trofozoítos a níveis similares àquele da clorexidina (50 µM), que é um fármaco já utilizado clinicamente. A nanoencapsulação aumentou a ação anti-Acanthamoeba do ß-cariofileno, mas não foi possível discriminar a formulação mais ativa (a densidade de carga ou tipo de quitosana não impactaram na atividade). Alterações espectrais (ATR-FTIR) mais significativas foram encontradas em córneas suínas tratadas com as NEs catiônicas e NPs de quitosana de médio peso molecular, o que motivou a seleção destas formulações para estudos de transporte transcorneal. Estas formulações aumentaram a retenção do terpeno na córnea suína, o que pode ser resultado da interação eletrostática dos nanocarreadores com a mucina e, para as NPs poliméricas, também se espera um efeito da quitosana no afrouxamento das junções aderentes entre as células epiteliais. Ainda, alterações morfológicas estromais decorrentes do tratamento com ß-cariofileno foram reduzidas após sua incorporação em NPs. Tendo em vista os resultados promissores alcançados até o momento, estudos in vivo são encorajados.

Abstract: Amoebic keratitis is a rare disease caused by Acanthamoeba spp., which most frequently affects immunocompromised individuals and contact lens wearers. The non-specific action of several drugs clinically used and resistant forms of the protozoan requires the use of high doses and a longer treatment time, which contributes to a higher incidence of adverse effects. In this context, natural products such as essential oils or their isolated compounds have been investigated as anti-Acanthamoeba candidates. A literature analysis was initially carried out to identify promising essential oils not only from the point of view of the aforementioned activity, but other secondary effects that would contribute to improving the disease course (e.g.: antiinflammatory, healing action). ß-caryophyllene, a major compound of several essential oils, has received attention due to its high anti-inflammatory effect, which also explain the various market formulations, and thus its anti-Acanthamoeba activity was exploited for the first time in this new study. As this terpene is susceptible to oxidation, has low aqueous solubility and high volatility, its incorporation into nanocarriers was considered. Anionic (Phosal® 50+) and cationic (cetrimonium bromide) nanoemulsions were prepared by spontaneous emulsification, demonstrating reduced size (<265 nm) and PdI (<0.2). Polymeric nanoparticles (NPs) with sodium tripolyphosphate (TPP) and low- or medium-molecular-weight chitosan were also prepared. A reduced size (203-240 nm), high surface charge (between +15 and +18 mV) and low PdI (close to 0.3) were found for these particles by adjusting the amount of TPP. Anionic nanoemulsions (NEs) and NPs stored at 4 and 25 °C demonstrated to be stable for up to 60 and 90 days, respectively, while cationic nanoemulsions were stable for 180 days under these same conditions. ß-caryophyllene, at a concentration of 200 µM, inhibited the growth of trophozoites to levels similar to that of chlorhexidine (50 µM), which is a drug already used clinically. Nanoencapsulation increased the anti-Acanthamoeba action of ß-caryophyllene, but the most active formulation was not identified as the charge density or type of chitosan did not impact the activity. More significant spectral changes (ATR-FTIR) were found in porcine corneas treated with cationic NEs and medium-molecular-weight chitosan NPs, which motivated the selection of these formulations for transcorneal transport studies. These formulations increased terpene retention in the porcine cornea, which may be a result of the electrostatic interaction of the nanocarriers with the mucin and, for polymeric NPs, an effect of chitosan on loosening the adherens junctions between epithelial cells is also expected. Furthermore, stromal morphological changes resulting from treatment with ß-caryophyllene were reduced after its incorporation into NPs. In view of the promising results achieved to date, in vivo studies are encouraged.