Exploring the potential of native microorganisms from diesel-contaminated areas for enhanced petroleum hydrocarbon degradation

Abstract

A introdução do biodiesel na matriz energética brasileira representa um avanço significativo em direção a fontes de energia mais sustentáveis. Por outro lado, o aumento do uso de composições binárias, como o diesel B20 (20% de biodiesel e 80% de diesel v/v), traz consigo o risco de contaminações ambientais resultante de eventuais derramamentos. Apesar do biodiesel ser suscetível à degradação microbiana, o óleo diesel mineral que compõe a maior parcela das misturas binárias, é composto por um conjunto complexo de hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos, reconhecidos pela sua toxicidade e persistência ambiental. Nesse contexto, a biorremediação, por meio do uso estratégico de microrganismos na recuperação de áreas impactadas por petroquímicos, apresenta-se como uma alternativa de baixo custo que permite a remediação permanente de contaminantes residuais. Sob essa perspectiva, este estudo objetivou coletar amostras em áreas experimentais contaminadas por diesel B20, prospectar espécies microbianas nativas e formular consórcios microbianos compatíveis com características metabólicas associadas à degradação aprimorada de hidrocarbonetos, incluindo a análise da produção de biossurfactantes e enzimas como a lacase. A análise cromatográfica (CG) das amostras de solo da área P05 do REMA revelou que, mesmo uma década após a liberação desses contaminantes, concentrações residuais de diversos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) e níveis elevados de hidrocarbonetos do grupo BTEX, como o benzeno, tolueno e xilenos, foram encontradas. Para área P10, valores acima da média recomendada foram verificados para os hidrocarbonetos xilenos, tolueno, naftaleno e antraceno. Um total de 19 isolados, representados por 7 fungos e 12 bactérias, foram obtidos após o enriquecimento das amostras de solo em meio mínimo, contendo óleo diesel como única fonte de carbono. A análise de caracteres macro- e micromorfológicos, em conjunto com o sequenciamento de regiões parciais dos genes 16S rRNA, Calmodulina (CaM) e ß-tubulina (BenA), permitiu a identificação dos isolados. O teste do colapso da gota, demonstrou que todos os fungos produzem moléculas tensoativas, com destaque para a linhagem de Trichoderma koningiopsis P05R2, que reduziu a tensão superficial do meio para 37,4 mN/m. A análise quantitativa da produção de lacases, evidenciou um rápido crescimento seguido por percentuais elevados de atividade enzimática para Stenotrophomonas maltophilia P05R11 (0,917 U/mL) e Trichoderma koningiopsis P05R2 (0,425 U/mL). Após os testes de antagonismo, quatro consórcios compatíveis foram formulados. A análise da degradação de HPAs e HTPs (C5-C40) presentes no óleo diesel revelou que os consórcios apresentaram uma capacidade de degradação significativamente superior em comparação com as cepas individuais. Os melhores resultados foram observados para um consórcio misto bacteriano-fúngico, composto por Trichoderma koningiopsis P05R2, Serratia marcescens P10R19 e Burkholderia cepacia P05R9, que apresentou um espectro de degradação =91% para todos os onze HPAs analisados, removendo 93,61% dos HPAs totais e 93,52% dos HTP (C5-C40). Esse achado destaca o potencial sinérgico entre bactérias e fungos como uma abordagem eficaz para a remoção de hidrocarbonetos complexos. Além disso, este estudo apresenta o primeiro relato de Trichoderma koningiopsis como um candidato à biorremediação, fornecendo bases científicas para o aprimoramento de tecnologias sustentáveis voltadas à recuperação de ambientes contaminados.

Abstract: The introduction of biodiesel into the Brazilian energy matrix represents a significant step toward more sustainable energy sources. However, the increasing use of binary fuel blends, such as B20 diesel (20% biodiesel and 80% diesel v/v), raises concerns regarding environmental contamination resulting from potential spills. Although biodiesel is susceptible to microbial degradation, mineral diesel, which constitutes the majority of these blends, is composed of a complex mixture of aliphatic and aromatic hydrocarbons known for their toxicity and environmental persistence. In this context, bioremediation, through the strategic use of microorganisms in the recovery of areas impacted by petrochemical contaminants, emerges as a cost-effective alternative that enables the permanent removal of residual pollutants. Under this perspective, this study aimed to collect samples from experimental sites contaminated with B20 diesel, prospect native microbial species, and formulate microbial consortia compatible with metabolic traits associated with enhanced hydrocarbon degradation, including the analysis of biosurfactant and laccase enzyme production. Chromatographic analysis (GC) of soil samples from the P05 area of REMA revealed that, even a decade after the release of these contaminants, residual concentrations of various polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and elevated levels of BTEX-group hydrocarbons, such as benzene, toluene, and xylenes, were detected. In the P10 area, levels exceeding the recommended average were observed for xylenes, toluene, naphthalene, and anthracene. A total of 19 microbial isolates, comprising 7 fungi and 12 bacteria, were obtained following the enrichment of soil samples in a minimal medium with diesel oil as the sole carbon source. Macro- and micromorphological characterization, combined with the sequencing of partial regions of the 16S rRNA, Calmodulin (CaM), and ß-tubulin (BenA) genes, enabled the identification of these isolates. The drop-collapse assay demonstrated that all fungal strains produced surfactant molecules, with Trichoderma koningiopsis P05R2 standing out by reducing the medium?s surface tension to 37.4 mN/m. Quantitative analysis of laccase production revealed rapid growth followed by high enzymatic activity levels, particularly in Stenotrophomonas maltophilia P05R11 (0.917 U/mL) and Trichoderma koningiopsis P05R2 (0.425 U/mL). Following antagonistic interaction tests, four compatible microbial consortia were formulated. The degradation analysis of PAHs and total petroleum hydrocarbons (TPHs, C5-C40) present in diesel oil demonstrated that the consortia exhibited significantly higher degradation capacities compared to individual strains. The most promising results were observed for a mixed bacterial-fungal consortium composed of Trichoderma koningiopsis P05R2, Serratia marcescens P10R19, and Burkholderia cepacia P05R9, which achieved a degradation spectrum of =91% for all eleven analyzed PAHs, removing 93.61% of total PAHs and 93.52% of TPH (C5-C40). This finding highlights the synergistic potential between bacteria and fungi as an effective strategy for the removal of complex hydrocarbons. Furthermore, this study presents the first report of Trichoderma koningiopsis as a candidate for bioremediation, providing a scientific basis for the advancement of sustainable technologies aimed at the recovery of contaminated environments.