Edição genética de linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae para o melhoramento de sua tolerância ao ácido acético

Abstract

Com a ascensão do etanol de segunda geração (E2G) no Brasil, é essencial superar desafios como a toxicidade do ácido acético no hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana. Esse inibidor compromete o crescimento de leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae, que são geneticamente modificadas para o consumo de xilose, sendo a espécie mais utilizada atualmente no processo de produção de E2G. Na forma não dissociada, o ácido acético atravessa passivamente a membrana plasmática das células, liberando H+ e CH3COO- (acetato) no citoplasma (pH ~7,0), o que compromete a viabilidade celular. Esse efeito é particularmente severo quando o pH do meio extracelular está abaixo do pKa do ácido (4,76) e/ou sua concentração varia entre 4 e 10 g L -1. Este estudo buscou melhorar a tolerância ao ácido acético da linhagem industrial MP-C5, que já expressa genes para o metabolismo da xilose, por meio da superexpressão dos genes TPO2 e RCK1 sob o promotor PTDH3. O gene TPO2 codifica uma proteína de membrana envolvida na expulsão de íons acetato via antiporte, enquanto RCK1 codifica uma proteína quinase associada à resposta ao estresse oxidativo causado pelo ácido acético. As linhagens recombinantes construídas foram avaliadas quanto à resistência ao ácido acético por ensaios de crescimento em meio sólido e em microescala. Também foram realizados ensaios fermentativos em meio sintético contendo 6 g L-1 do inibidor (MS) e em meio suplementado com hidrolisado hemicelulósico (HH) para avaliar seu desempenho em diferentes condições. A linhagem MRG-RCK1 apresentou maior produtividade de glicerol, sugerindo ativação da via High-Osmolarity Glycerol (HOG) para resposta ao estresse, além de um rendimento (YP/S) de 0,37 g g-1e produtividade de 1,77 g L-1 h- 1, superando a linhagem parental MP-C5. Já MRG-TPO2 teve menor consumo de xilose, possivelmente devido ao impacto da superexpressão de TPO2 na atividade da H+-ATPase (Pma1p), reduzindo a disponibilidade de ATP para a utilização de xilose. Os resultados indicam que MRG-RCK1 é uma linhagem promissora para aplicações industriais onde o hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar é utilizado na produção de E2G.

Abstract: With the rise of second-generation ethanol (E2G) in Brazil, it is essential to overcome challenges such as the toxicity of acetic acid in the hemicellulosic hydrolysate of sugarcane bagasse. This inhibitor compromises the growth of yeast of the species Saccharomyces cerevisiae, which is genetically modified for xylose consumption and is currently the most used species in the E2G production process. In its undissociated form, acetic acid passively crosses the plasma membrane of cells, releasing H+ and CH3COO- (acetate) in the cytoplasm (pH ~7.0), which affects cell viability. This effect is particularly severe when the extracellular medium pH is below the acid's pKa (4.76) and/or its concentration ranges between 4 and 10 g L-1. This study aimed to improve the acetic acid tolerance of the industrial strain MP-C5, which already expresses genes for xylose metabolism, by overexpressing the TPO2 and RCK1 genes under the PTDH3 promoter. The TPO2 gene encodes a membrane protein involved in the expulsion of acetate ions via antiport, while RCK1 encodes a protein kinase associated with the oxidative stress response caused by acetic acid. The constructed recombinant strains were evaluated for acetic acid resistance through solid medium and microscale growth assays. Additionally, fermentation assays were conducted in synthetic medium containing 6 g L-1 of the inhibitor (MS) and in a medium supplemented with hemicellulosic hydrolysate (HH) to assess their performance under different conditions. The MRG-RCK1 strain exhibited higher glycerol productivity, suggesting activation of the High-Osmolarity Glycerol (HOG) pathway for stress response, as well as a yield (YP/S) of 0.37 g g-1 and productivity of 1.77 g L-1 h-1, outperforming the parental strain MP-C5. On the other hand, MRG-TPO2 showed lower xylose consumption, possibly due to the impact of TPO2 overexpression on H+-ATPase (Pma1p) activity, reducing ATP availability for xylose utilization. The results indicate that MRG-RCK1 is a promising strain for industrial applications where sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolysate is used in E2G production.