Neuroproteção por guanosina em um modelo de isquemia cerebral in vitro: avaliação da sinalização celular e da função mitocondrial

Abstract

O acidente vascular cerebral (AVC) é a segunda causa morte mundialmente. A isquemia cerebral provoca a interrupção do suprimento de glicose e oxigênio ao tecido, causando um colapso no metabolismo energético, que precede a disfunção mitocondrial e ocasiona a morte celular por apoptose. A guanosina (GUO) é um nucleosídeo endógeno que promove efeitos protetores contra os danos celulares induzidos pela isquemia. Neste trabalho investigamos o envolvimento dos receptores de adenosina A1 e A2A e da proteína cinase A (PKA) sobre os efeitos protetores da GUO em um modelo de isquemia cerebral in vitro. Fatias de hipocampo (400 µm) obtidas de camundongos Swiss machos foram submetidas a 15 minutos de privação de glicose e oxigênio e reoxigenação (PGO/R) e 120 minutos de reoxigenação. Guanosina (30 µM) foi adicionada 15 minutos antes e durante a PGO, e mantida por todo o período de reoxigenação. O dano de membrana celular foi avaliado pelo método de incorporação de iodeto de propídio (IP). O consumo de oxigênio mitocondrial foi mensurado pela técnica de respirometria de alta resolução com um oxígrafo (Oroboros Oxygraph-2k), imediatamente após o protocolo de PGO/R. As análises estatísticas foram realizadas no software GraphPad Prism 8.0. Fatias hipocampais submetidas à PGO/R apresentaram um aumento significativo na incorporação de IP, em relação ao grupo controle, enquanto o tratamento com 30 µM GUO preveniu este dano. As fatias submetidas à PGO/R apresentaram uma redução no consumo de oxigênio mitocondrial em relação ao grupo controle. A adição de 30 µM GUO recuperou o consumo de oxigênio em diferentes estados mitocondriais mesmo após os danos da PGO/R. A presença de CCPA, um agonista do receptor A1, inibiu os efeitos da GUO sobre a incorporação de IP e o consumo de oxigênio. Enquanto a presença de CGS21680, um agonista do receptor A2A, promoveu efeitos protetores per se e não modificou a ação protetora da GUO. A inibição da enzima PKA pelo inibidor H-89, aboliu os efeitos protetores promovidos pela GUO sobre o dano celular e a função mitocondrial. Este trabalho demonstrou que a GUO apresenta efeitos protetores contra os danos associados à PGO/R, como a permeabilização da membrana celular e a redução da função mitocondrial. Esses efeitos da GUO são dependentes dos receptores de adenosina A1 e A2A e da sinalização da enzima PKA.

Abstract: Stroke is the second leading cause of death, and ischemic stroke accounts for more than 60% of cases worldwide. The interruption in the supply of glucose and oxygen to brain tissue causes the breakdown of energy metabolism, which precedes mitochondrial dysfunction and oxidative stress, and induces cell death by apoptosis. The endogenous nucleoside guanosine (GUO) presents neuroprotective effects against cell damage caused by ischemia. We investigated the involvement of adenosine A1 and A2A receptors and protein kinase A (PKA) in the neuroprotective effects of GUO. Hippocampal slices (400 µm) obtained from male Swiss mice were subjected to 15 minutes of glucose and oxygen deprivation and reoxygenation (OGD) and 120 minutes of reoxygenation. Guanosine (30 µM) was added 15 minutes before and during PGO, and maintained throughout the reoxygenation period. Cell membrane damage was assessed through the propidium iodide (PI) probe incorporation by fluorescence measurement. Mitochondrial oxygen consumption was measured in hippocampal slices by high-resolution respirometry with the Oroboros Oxygraph-2k immediately after the OGD/R protocol. Statistical analyses were performed by GraphPad Prism 8.0 (n = 4-5). Slices subjected to PGO/R showed a reduction in mitochondrial oxygen consumption compared to the control group. GUO (30 µM) recovered oxygen consumption in different mitochondrial states even after PGO/R damage. The presence of CCPA, an A1 receptor agonist, inhibited the effects of GUO on cell damage and oxygen consumption, while the presence of CGS21680, an A2A receptor agonist, promoted protective effects per se and did not modify the protective action of GUO. The inhibition of the PKA enzyme by H-89 abolished the protective effects of GUO on cell damage and mitochondrial function. Treatment with 30 µM guanosine showed neuroprotective effects in hippocampal slices submitted to OGD/R, recovering cell viability and preventing mitochondrial dysfunction by increasing oxygen consumption. These effects are dependent on adenosine A1 and A2A receptors and PKA signaling.