Isolamento e análise do potencial hidrolítico de leveduras da microbiota de matas de araucárias do Sul do Brasil

Abstract

As leveduras desempenham papéis fundamentais nos ecossistemas, participando ativamente na ciclagem de nutrientes e interagindo simbioticamente com outros organismos. Glicosil-hidrolases (GHs), como celulases, xilanases e ß-glicosidases, são enzimas utilizadas em processos industriais, incluindo produção de alimentos, biocombustíveis e tratamento de efluentes. Paralelamente, leveduras oleaginosas (capazes de acumular >20% de lipídios em biomassa) e produtoras de lipases/esterases representam fontes promissoras para biotecnologia, especialmente na produção de biocombustíveis e alimentos. Em vista desses produtos oriundos de leveduras, a exploração da biodiversidade de leveduras em ecossistemas preservados, como a Mata de Araucárias da Floresta Nacional de Chapecó (SC, Brasil), surge como estratégia para identificar microrganismos com potenciais enzimáticos e metabólicos aplicáveis a processos industriais mais eficientes e sustentáveis. Foram isoladas 30 linhagens de leveduras a partir de solo, serrapilheira e casca de Araucaria angustifolia, obtidas em cultivos a 11°C e 30°C. A caracterização filogenética a partir de UPGMA, utilizando fingerprints obtidos pelo produto de sequências simples repetitivas, foi capaz de agrupar os isolados por proximidade genética. Ensaios de cultivos em microescala, utilizando meios sintéticos contendo diferentes carboidratos presentes em resíduos lignocelulósicos, apresentaram taxas de crescimento (µmax) entre 0,32?0,47 h-1. As atividades enzimáticas de celulase e xilanases avaliadas, após a hidrólise da carboximetilcelulose e da xilana, utilizando o método do DNS demonstraram baixas atividade celulolíticas, enquanto para as xilanolíticas, a linhagem CHAP-274 destacou-se em ambas as temperaturas de hidrólise avaliadas (30°C: 100,27 ± 24,44 U/mL; 50°C: 156,84 ± 39,58 U/mL). Os ensaios de atividades de ß-glicosidase extracelulares e referentes as células foram avaliadas utilizando o p-nitrofenil-ß-D-glicopiranosideo, as linhagens CHAP-258, CHAP-277 e CHAP-278 apresentaram as maiores atividades. Quando avaliada a cinética enzimática dessas três linhagens, verificou-se alta afinidade com a celobiose (com Km variando de 20,72 a 131,63 mM) e velocidades máximas que oscilaram de 243,97 a 723,40 U/mg de células. Quando avaliado a capacidade de acumular lipídeos,12 linhagens foram identificadas como oleaginosas pelo teste com rodamina B presentes nos meios sólidos. Além disso, 9 linhagens apresentaram atividade esterase, quando avaliadas em meio sólido contendo Tween 80 e sais, que formavam halos de degradação devido a degradação do surfactante pela presença da enzima. Por fim, ensaios com p-nitrophenyl palmitato, 8 linhagens exibiram atividade lipolítica, com destaque para CHAP-260 (55,55 ± 4,06 U/L) e CHAP-261 (45,06 ± 2,45 U/L). A linhagem CHAP-270 mostrou atividade esterase, mas baixa lipolítica. Desse modo, as linhagens isoladas e caracterizadas possuem grande potencial biotecnológico, produzindo enzimas e lipídios a partir de substratos oriundos de resíduos agrícolas e florestais, apresentando potencial na utilização em bioprocessos sustentáveis. Nossos resultados indicam também o potencial de Matas de Araucárias como relevante fonte de bioprospecção de leveduras.

Abstract: Yeasts play fundamental roles in ecosystems by actively participating in nutrient cycling and establishing symbiotic interactions with other organisms. Glycosyl hydrolases (GHs), such as cellulases, xylanases, and ß-glucosidases, are enzymes utilized in industrial processes, including food production, biofuel generation, and effluent treatment. Concurrently, oleaginous yeasts (capable of accumulating >20% lipids in their biomass) and producers of lipases/esterases represent promising sources for biotechnology, particularly in biofuel and food production. Given these yeast-derived products, exploring yeast biodiversity in preserved ecosystems?such as the Araucaria Forest of the Chapecó National Forest (SC, Brazil)?emerges as a strategy to identify microorganisms with enzymatic and metabolic potentials applicable to more efficient and sustainable industrial processes.Thirty yeast strains were isolated from soil, litter, and bark of Araucaria angustifolia, cultivated at 11°C and 30°C. Phylogenetic characterization via UPGMA, using fingerprints from simple sequence repeat amplification, grouped isolates by genetic proximity. Microscale cultivation assays in synthetic media containing different lignocellulosic waste carbohydrates yielded maximum growth rates (µmax) ranging from 0.32 to 0.47 h-1. Enzymatic activities of cellulase and xylanases were assessed after hydrolysis of carboxymethyl cellulose and xylan using the DNS method, revealing low cellulolytic activities. For xylanolytic activity, strain CHAP-274 stood out at both hydrolysis temperatures (30°C: 100.27 ± 24.44 U/mL; 50°C: 156.84 ± 39.58 U/mL). Extracellular and cellular ß-glucosidase activities, evaluated using p-nitrophenyl-ß-D-glucopyranoside, identified strains CHAP-258, CHAP-277, and CHAP-278 as the highest producers. Kinetic analysis of these three strains demonstrated high affinity for cellobiose (Km values: 20.72?131.63 mM) and maximum reaction rates (Vmax) ranging from 243.97 to 723.40 U/mg cells. Regarding lipid accumulation, 12 strains were identified as oleaginous using the Rhodamine B assay on solid media. Furthermore, 9 strains exhibited esterase activity on solid media containing Tween 80 and salts, forming degradation halos due to surfactant hydrolysis. Finally, in assays with p-nitrophenyl palmitate, 8 strains displayed lipolytic activity, with CHAP-260 (55.55 ± 4.06 U/L) and CHAP-261 (45.06 ± 2.45 U/L) showing the highest activities. Strain CHAP-270 exhibited esterase activity but low lipolytic activity. Thus, the isolated and characterized strains hold significant biotechnological potential for producing enzymes and lipids from agricultural and forestry waste substrates, demonstrating applicability in sustainable bioprocesses. Our results also indicate the Araucaria Forest as a relevant source for yeast bioprospecting.