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Abstract:
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O objetivo do estudo foi verificar a ação da homocisteína (HC) e do ácido fólico (AF), isoladamente e em conjunto, no desenvolvimento embrionário, com ênfase no padrão morfológico, neurulação e estrutura organizacional do telencéfalo (TEL) e medula espinhal embrionária (ME); para tanto, utilizamos o modelo de Gallus domesticus. Foram constituídos 5 grupos experimentais: 2 controles # Controle Fechado (GC1) e Controle Salina (GC2) # e 3 tratados # HC (G3), HC e AF (G4) e AF (G5), cada um com N=10. Ovos fertilizados foram numerados, pesados e incubados em estufa apropriada (38°C e 65% de umidade). Após 32 horas (8-9HH), foram retirados da estufa e efetuouse uma abertura na face superior mediana do ovo (1,5cm de diâmetro). Esta permitiu a visualização do embrião e o tratamento: 25Yl de salina (GC2), 10Ymol de D,L-HC/25Yl de salina (G3), 0,5Yg de AF+10Ymol de D,L-HC/25Yl de salina (G4) e 0,5Yg de AF/25Yl de salina (G5). Concluída a manipulação, a abertura era fechada com filme PVC atóxico e o ovo recolocado na estufa. O GC1 não foi submetido aos procedimentos de abertura e tratamento. Após 96 horas (23-25HH), os embriões foram dessensibilizados à 4°C e posteriormente analisados ao estereomicroscópio, para detecção de alterações do padrão morfológico, determinação do estágio de desenvolvimento (HH) e mensuração cefálica e corporal (14, 20 e 30X). Em seguida, foram fixados em formol 10% (24h) e conservados em etanol 70%, tendo a massa corporal aferida após 5 dias. A região cefálica e truncal dos embriões foi preparada para microscopia, e os cortes (8Ym) foram submetidos às técnicas de hematoxilina-eosina (HE), para descrição geral e posterior morfometria das camadas celulares do TEL e ME, e quantificação celular da notocorda e mesoderma apical à ME; técnica de Hoescht (33258), para evidenciar células em apoptose; e técnicas imuno-histoquímicas, para localizar dos filamentos intermediários vimentina e GFAP. A partir da análise estereomicroscópica, foi possível identificar que a porcentagem de embriões que apresentaram padrão morfológico normal foi de 100% em GC1 e GC2, e de 70% em G5. Já em G3 e G4 a porcentagem foi de 20 e 30%, respectivamente, e a diferença significativa entre estes dois e os demais grupos. Através da análise morfométrica realizada nos embriões, observamos que os grupos GC1 e GC2, geralmente, apresentaram valores médios superiores aos demais grupos tratados, com exceção de G5, que exibiu médias semelhantes a dos grupos controle. Em contrapartida, G3 exibiu quase sempre as menores médias, embora as diferenças não fossem significativas. Comportamento semelhante foi apresentado, quanto à morfometria das camadas celulares # ventricular e do manto #, tanto do TEL, quanto da ME. A espessura média destas camadas, foi, quase sempre, significativamente superior nos grupos controle em comparação aos grupos G3 e G4. Os cortes da região truncal exibiram abertura da região apical da ME # G4 # acompanhada de falha na fusão do mesoderma apical à ME # G3. Através das técnicas imunohistoquímicas, foi possível identificar diferenças na intensidade e localização dos filamentos intermediários vimentina e GFAP, tanto no TEL quanto na ME e adjacências, entre os grupos controle (GC1 e GC2) e tratados (G3, G4 e G5). Com relação à apoptose, foi possível evidenciá-la, no TEL e ME, somente em G4. Portanto, o tratamento com HC (G3) foi o que mais interferiu, tanto no padrão morfológico, quanto na estrutura organizacional do TEL e ME. Já o tratamento com AF (G5) não interferiu, de forma significativa, nestes mesmos parâmetros. E o AF, administrado concomitantemente com a HC (G4), não foi capaz de anular os efeitos nocivos desta substância, provavelmente, em decorrência da imaturidade metabólica dos embriões. The objective of the study was to verify the action of homocysteine (HC) and folic acid (AF), separately and in set, in the embryonic development, with emphasis in morphologic pattern, neurulation and organization of telencephalon (TEL) and embryonic spinal cord (SP); for this, we used the model of Gallus domesticus. Five experimental groups had been constituted: 2 controls # Closed Control (CG1) and Saline Control (CG2) - and 3 treated - HC (G3), HC + FA (G4) and FA (G5), each one with N=10. Fertilized eggs had been numbered, weighed and incubated at 38°C and 65% humidity. After 32h in stove (8-9HH), a window was opened on the egg´s surface (1.5 cm diameter), that allowed the visualization of embryo and the treatment: 25Yl saline (CG2), 10Ymol D, L-HC/25Yl saline (G3), 0,5Yg FA + 10Ymol D, L-HC/25Yl saline (G4) and 0,5Yg AF/25Yl saline (G5). After egg window was closed with film atoxic PVC and the eggs returned for the incubator. The CG1was not submitted to the procedures of opening and treatment. After 96 hours (23-25HH) embryos were dessensibilized at 4°C, removed from egg and analyzed to stereomicroscope (20X), for detention of alterations of morphologic pattern, determination of development stage (HH) and morphometrical analysis (14, 20 and 30X). After the embryos were fixed in formaldehyde 10% (24h) and maintained in ethanol 70%. After the corporal mass was measuared and embryos were prepared for microscopy. The serial sections (8Ym) were submitted to techniques of Hematoxylineosin (HE), for general description, morphometrical analysis of the cellular layers of the TEL and SC, and cellular quantification of notochord and apical mesoderm; Hoescht (33258) to evidence cells in apoptose; and immunohistochemistry techniques to locate of intermediate filaments vimentin and GFAP. From the stereomicroscopical analysis it was possible to identify that the percentage of embryos that had showed normal morphologic pattern in GC1 and GC2 (100%) and in G5 (70%). Already in G3 and G4 the percentage was respectively of 20 and 30% with significant difference between these two and too much groups. In morphometrical analysis of the embryos we observe that CG1 and CG2 generally had showed superior average values when compared with too much groups, with exception of G5, that showed similar averages to control groups. On the other hand, G3 almost always showed the average inferiors even so the differences were not significant. Similar behavior was presented also in the morphometrical analysis of the cellular layers - ventricular and of the mantle -, as much of the TEL how much of SC. The average thickness of these layers was almost always significantly superior in the control groups when compared with groups G3 and G4. The slices of the trunk region had shown opening of the apical region of SC - G4 # and also failure in the fusion of the apical mesoderm - G3. Through immunohistochemistry techniques it was possible to identify differences in the intensity and localization of intermediate filaments vimentin and GFAP between the control groups (GC1 and GC2) and treated groups (G3, G4 and G5), as much in the TEL how much in SC and surroundings. Apoptosis had been evidenced only in the TEL and SC of G4. The treatment with HC (G3) interfered more, as much in morphologic pattern how much in organization of TEL and SC. Although treatment with FA (G5) did not interfere of significant form in these same parameters, when managed in set with HC (G4), it was not capable to annul the harmful effect of this substance, probably due to metabolic immaturity of embryos. |
