Genes diferencialmente expressos em camarões de cultivo Litopennaeus vannamei infectados pelo vírus da Síndrome da Mancha Branca e genotipagem de isolados geográficos brasileiros do vírus

Abstract

O vírus da Síndrome da Mancha Branca (WSSV) é uma doença que afeta várias espécies de crustáceos, causando grandes mortalidades e perdas econômicas em regiões produtoras de camarão. Este trabalho teve como objetivo padronizar a metodologia de PCR em Tempo Real para a detecção do WSSV, genotipar isolados geográficos do vírus e isolar genes diferencialmente expressos em camarões de cultivo infectados com WSSV. Amostras positivas e negativas por PCR nested foram analisadas através de PCR em Tempo Real. A carga viral das amostras foi determinada e algumas amostras negativas por PCR nested foram positivas por PCR em Tempo Real, com baixa carga viral. Vírus isolados de camarões coletados em Santa Catarina e na Bahia foram comparados quanto ao padrão de três minissatélites, à presença de uma grande deleção e uma transposase. Todas as amostras de Santa Catarina tiveram o mesmo padrão para os minissatélites analisados.As amostras da Bahia apresentaram um padrão diferente para os loci analisados, indicando que existem dois genótipos de WSSV diferentes no Brasil. Os isolados brasileiros tem uma deleção de 10,780 bp na ORF 23/24 e não possuem a seqüência da transposase. O padrão de repetições para os três minissatélites analisados foi diferente entre os isolados brasileiros e de outros países da América. Entretanto, ao analisar apenas a ORF 94, Santa Catarina, México, Nicarágua, Honduras e Panamá têm mais de nove repetições, enquanto a Bahia e os EUA têm menos de nove repetições. Esta similaridade pode estar relacionada a uma similaridade em virulência. Aparentemente, os WSSVs encontrados na Bahia e em Santa Catarina originaram-se de diferentes fontes de contaminação ou o vírus sofreu mutações ao longo do tempo. mRNA foi extraído das brânquias de camarões infectados e não-infectados com o WSSV, reversamente transcrito e uma hibridização subtrativa (SSH) foi realizada. A Biblioteca 1 (genes induzidos) tem 300 clones dos quais foram formados 36 contigs e 36 singlets. Destas seqüências, 69 (88,4%) são similares a seqüências no GeneBank. Na Biblioteca 2 (genes reprimidos), de 403 clones, foram formados 23 contigs e 36 singlets e 40 (75,5%) são similares a seqüências conhecidas. Estes genes foram organizados em grupos, de acordo com a sua função. Dentre os genes induzidos há genes envolvidos na síntese de ATP, citoesqueleto, adesão celular, metabolismo e transporte de moléculas. Dentre os genes reprimidos, há genes envolvidos na defesa contra bactérias, transdução de sinal e biossíntese de ácidos nucléicos. A infecção pelo WSSV parece alterar várias rotas metabólicas diferentes.

White Spot Syndrome Virus (WSSV) is a disease that affects several species of crustaceans, causing high mortality rates, which has been causing great economical losses in shrimp farming regions. The aims of this study were to standardize the Real Time PCR methodology for WSSV detection, to genotype geographical isolates of the virus and to isolate differentially expressed genes in farmed shrimps infected with WSSV. Samples positives and negatives by nested PCR were analyzed by Real Time PCR. The viral load of the samples was determined and some samples negative by nested PCR were positive by Real Time PCR, with low viral load. The pattern of three minisatellite regions, the presence of a deletion and a transposase were compared in virus isolated from shrimp collected in Santa Catarina and Bahia. All Santa Catarina samples had the same pattern for the minisatellites analyzed. Bahia samples showed a different pattern for the loci, indicating that there are two different ORF 23/24 and do not have a transposase sequence. The repeat number pattern for the three minisatellite analyzed was different between the Brazilian isolates and isolates from America#s countries. However, when analyzing only ORF 94, South Brazil, Mexico, Nicaragua, Honduras and Panama have all more than nine repeats, while Northeast Brazil and USA samples have less than nine repeats. This similarity of repeats could be related to a similarity in virulence. Our results show that WSSV found in Bahia and Santa Catarina States have originated from different sources of contamination or the virus have undergone mutations during time. mRNA was extracted from gills of shrimps infected and non-infected with WSSV, reverse transcribed and a suppression subtractive hybridization (SSH) was performed. Library 1 (induced genes) has 300 clones, which formed 36 contigs and 36 singlets. Of these sequences, 69 (88,4%) are similar to sequences in GeneBank. Library 2 (repressed genes), has 403 clones, which formed 23 contigs and 36 singlets, and 40 sequences (75,5%) are similar to known sequences. These genes were organized in groups, according to their functions. Among the induced genes there are genes involved in ATP synthesis, cytoskeleton, cell adhesion, metabolism and molecule transport. Among the repressed genes, there are genes involved in antibacterial defence, signal transduction and nucleic acids biosynthesis. WSSV infection seems to alter several metabolic routes.