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Neste estudo foi padronizada a reação de RT-PCR para detectar a expressão de mRNA de IL-2, para seleção in vitro de substâncias naturais ou sintéticas com potencial atividade imunomodulatória sobre linfócitos T, visto que estes constituem uma das maiores classes de linfócitos e são importantes na regulação da resposta imune inata e adaptativa. Para isso foi utilizada a linhagem de células Jurkat, que são derivadas do tecido hematopoiético humano e produzem IL-2 após estimulação celular com lectinas. Para a realização da reação de RT-PCR, o RNA foi extraído das células Jurkat utilizando-se o reagente Trizol e posteriormente tratado com DNase para obter maior pureza do RNA . Para a padronização da reação de amplificação, foram testados diferentes tampões de reação e temperatura de ligação do iniciador. Os produtos de IL-2 foram confirmados por sequenciamento. Também foi padronizado o tempo e a concentração de Fitohemaglutinina (PHA) utilizada para estimular as células, que foi de 24 horas e 1 µg/ml, respectivamente. Além disso, a Ciclosporina A (CsA) foi selecionada como controle de inibição celular. Após padronização da RT-PCR, foram testados os galatos e os polissacarídeos de Agaricus blazei. Muitos estudos demonstraram que estes compostos possuem atividades farmacológicas, incluindo ações anticancerígenas, antibacteriana, antivirais, entre outras. A citotoxicidade (CC50) dos compostos utilizados foi determinada pelos ensaios colorimétricos MTT e/ou Vermelho Neutro. Dos 15 galatos testados, somente os galatos de propila, butila, octila, nonila, decila, undecila, dodecila e tetradecila, apresentaram atividade de estimulação celular e dos 15 polissacarídeos de Agaricus blazei, somente 3 mostraram-se positivos: polissacarídeo 3, extraído da frutificação e separado por membrana de ultrafiltração 1, polissacarídeo 4, extraído da frutificação e separado por membrana de ultrafiltração 2 e o polissacarídeo 7, extraído do micélio em grãos de trigo e separado por membrana de microfiltração. Paralelamente, foi realizada a imunofenotipagem das células Jurkat e feita à avaliação da estimulação celular por citometria de fluxo. Dentre os marcadores celulares testados (CD25/CD3) a frequência de células positivas para CD25 foi a que melhor refletia a ativação das células Jurkat, porém com menor sensibilidade do que a RT-PCR. Neste estudo, portanto, ficou evidenciada a utilidade de uma técnica in vitro para triagem de substâncias com potencial atividade imunomodulatória sobre linfócitos T, o que permite vislumbrar a análise de grande número destas substâncias, sem utilização de animais de laboratório. |
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