Expressão recombinante de uma crustina do camarão nativo Farfantepenaeus paulensis e determinação de seu local de síntese através de imunomarcação

Abstract

Crustinas são peptídeos antimicrobianos que integram o sistema imune inato dos crustáceos e atuam na defesa destes animais contra infecções, juntamente com outras moléculas imunoefetoras presentes na hemolinfa. O objetivo do presente trabalho foi clonar e expressar, em sistema heterólogo, uma crustina do camarão nativo Farfantepenaeus paulensis para avaliar sua atividade antimicrobiana e produzir anticorpos policlonais para imunolocalizar este peptídeo nas diferentes populações de hemócitos deste peneídeo, assim como em diferentes grupos de crustáceos. Por abordagem molecular, foi possível clonar uma sequência gênica correspondente a uma crustina, com características do subgrupo da crustina I, que denominamos de crusFpau2. A crusFpau2 apresentou 94% de homologia com a única isoforma já descrita em F. paulensis (crusFpau). Esta nova isoforma caracteriza-se por apresentar uma região N-terminal rica em resíduos de glicina, além da região C-terminal com doze resíduos conservados de cisteína, onde se encontra um domínio WAP (whey acidic protein). A crusFpau2 foi expressa em E. coli BL21(DE3)pLysS com peso molecular de 17,3 kDa e foi utilizada para avaliar sua atividade antimicrobiana e produzir anticorpos policlonais em camundongo. A crustina recombinante mostrou-se ativa contra a bactéria Micrococcus luteus. Através de imunomarcação foi possível determinar que as crustinas são produzidas de forma constitutiva apenas nos hemócitos granulares (HGs) de F. paulensis, sendo armazenadas em seus grânulos. Aparentemente, estas proteínas não são processadas no interior dos grânulos e não são secretadas para a hemolinfa. Os anticorpos produzidos contra a crusFpau2 recombinante foram ainda capazes de reconhecer especificamente crustinas nos hemócitos granulares de outros grupos de crustáceos (Litopenaeus vannamei, Macrobrachium potiuna e Callinectes sapidus), mas não no mexilhão marinho Perna perna. Estes resultados sugerem que as crustinas são peptídeos de ocorrência geral em crustáceos. Este é o primeiro trabalho que produziu um peptídeo antimicrobiano a partir de uma espécie nativa brasileira de crustáceos marinhos, além de produzir os primeiros anticorpos contra crustinas até o momento. Estes anticorpos constituem uma ferramenta importante para imunomarcar especificamente populações de hemócitos granulares de crustáceos, além de auxiliar a uma melhor compreensão do sistema imune deste grupo zoológico, que inclui muitas espécies de interesse econômico. Por fim, uma avaliação futura mais detalhada do seu real espectro antimicrobiano poderá revelar o seu potencial promissor como agente terapêutico para aquicultura e saúde humana.