Produção de biomassa do fungo Agaricus subrufescens por processos fermentativos sólido e submerso para obtenção de polissacarídeos bioativos

Abstract

Agaricus subrufescens (=A. brasiliensis) é um fungo comestível amplamente comercializado no Brasil e em outros países, devido as suas propriedades nutricionais e medicinais relacionadas principalmente aos polissacarídeos presentes em sua parede celular, tais como glucanas e glucomananas. Certos processos biotecnológicos têm sido utilizados para aumentar a escala produtiva do micélio e, consequentemente, aumentar a obtenção dos polissacarídeos. Previamente ao desenvolvimento desses processos de produção é importante estabelecer métodos de preservação do fungo in vitro e a recuperação do micélio após estocagem. Para a produção de biomassa foi utilizada a fermentação no estado sólido (FES) em grãos de trigo pré-tratados e a fermentação submersa (FSm) em hidrolisados de resíduos agroindustriais, como farelo de trigo (FT) e resíduo de cervejaria (RC). Polissacarídeos extraídos da frutificação (controle), do micélio em FES e do micélio isolado da FSm foram separados de acordo com suas massas molares por meio de diferentes membranas. Essas frações de polissacarídeos foram testadas na ativação de macrófagos in vitro. Entre os métodos de preservação, melhores resultados foram obtidos quando o meio de cultura foi suplementado com carvão ativo, tanto para a preservação quanto para a recuperação de A. subrufescens, sem alterações significativas na morfologia e genética do fungo durante um período de até 12 meses de estocagem. Para a FES, 21 min de cozimento dos grãos de trigo seguido de 24 min de molho após o cozimento demonstrou ser mais adequado para a produção de polissacarídeos (glucomananas) pelo fungo, inclusive quando o substrato não foi suplementado com cálcio, ou com adição máxima de 0,25 % CaCO3 (pH 6,6). A quantidade inicial de inoculante para a melhor produção de glucomananas (6,89 mg.mL-1) foi aproximadamente 10,3 %, numa temperatura ótima de incubação de 27,2 °C. As maiores biomassas de A. subrufescens para a FSm em hidrolisados de RC e FT foram obtidas na concentração de HCl 0,45 % e 20 min de hidrólise, apresentando 9,65 g.L-1 e 22,1 g.L-1, respectivamente. Porém, melhores resultados de bioconversão foram obtidos em hidrolisados utilizando até 0,3 % de HCl e 30 min de hidrólise, com adição de 2 g.L-1 de carvão ativo durante a hidrólise. Também foram obtidas altas taxas de biomassa de A. subrufescens no cultivo em hidrolisado com pH 5,3 e temperatura de incubação de 30,2 ºC. Na separação com membranas houve aumento da retenção dos polissacarídeos de todos os extratos à medida que o tamanho dos poros da membrana diminuiu. Os polissacarídeos separados pelas membranas de microfiltração (MF) e ultrafiltração (UF1) favoreceram a retenção de polissacarídeos de maior massa molar da frutificação (627 g.mol-1) e do micélio (310 g.mol-1), obtido tanto em FES quanto em FSm. Todos os polissacarídeos extraídos e retentados pelas membranas ativaram macrófagos através da expressão do Fator de Necrose Tumoral-a (TNF-a). Porém, somente os extratos brutos da frutificação e do micélio isolado da FSm, e seus polissacarídeos de maior massa molar retidos pela membrana MF ativaram macrófagos através da expressão de Óxido Nítrico Sintase Induzível (iNOS). Resultados importantes também foram obtidos para os polissacarídeos das frutificações de A. subrufescens, apresentando efeito antigenotóxico e atividade antiherpética quando esses foram sulfatados. Baseado nesses resultados, pesquisas complementares estão sendo desenvolvidas para a obtenção de produtos biotecnológicos com finalidade nutricêutica e/ou farmacêutica.

Agaricus subrufescens (=A. brasiliensis) is an edible fungus widely commercialized in Brazil and other countries, mainly due to its nutritional and medicinal properties related principally to the polysaccharides present in the fungus cell wall, such as glucans and glucomannans. Biotechnological processes may in turn be used to scale up the production of mycelium and consequently the polysaccharides. Previous to the development of the production process it is important to establish techniques for the in vitro preservation and recovery of the mycelium after storage. Solid state fermentation (SSF) on pre-treated wheat grains and submerse fermentation (SmF) on hydrolyzed residues from the agro industries, such as wheat bran (FT) and brewery residues (RC) were used for biomass production. Polysaccharides extracted from fruiting bodies (control), mycelium on SSF and isolated mycelium from SmF were separated by molecular weight through different membranes. These polysaccharide fractions were tested on macrophage activity in vitro. Among the preservation techniques, better results were obtained when the media was supplemented with activated charcoal both for preservation and further recovery of A. subrufescens, without significant morphological and genetic changes within the 12 month storage period. For SSF, 21 min of wheat grain cooking followed by a 24 min resting time has shown to be the optimal condition for the production of polysaccharides (glucomannans) by the fungus, either with no supplement added, or when up to 0.25 % CaCO3 (pH 6.6) has been added to the substrate. The initial inoculum amount for the best polysaccharide production levels (6.89 %) was around 10.3 % with an optimal temperature of 27.2 °C. The highest biomass of A. subrufescens for the SmF in hydrolyzed RC and FT using HCL 0.45% and 20 min hydrolysis was 9.65 g.L-1 and 22.1 g.L-1, respectively. On the other hand, better results of bioconversion were obtained in hydrolyzed residues using up to 0.30 % HCl and 30 min hydrolysis, with the addition of 2 g.L-1 of activated charcoal throughout the process. High biomass levels were also obtained when the cultivation was carried out at a pH of 5.3 and with incubation temperature of 30.2 ºC. The results showed an increase in retention of all polysaccharide extracts as the membro ane porosity decreased. Microfiltration (MF) and ultrafiltration (UF1) membranes retained the highest polysaccharides from fruiting body (627 g.mol-1) and mycelium (310 g.mol-1) obtained on both SSF and SFm. All polysaccharide extracts and fractions separated by the membranes showed biological activity for TNF-a cytokines. On the other hand, only extracts obtained from fruiting bodies and isolated mycelium of FSm, and its high molecular weight polysaccharides retained by the MF membrane activated the iNOS. Important results were also obtained for the polysaccharides extracted from the fruiting bodies, showing antigenotoxic and antiherpetic activities after sulphatation. Based on these findings, additional research is currently in progress to purpose biotechnological products that can be used in both the nutraceutical and/or pharmaceutical areas.