Detecção e quantificação de patógenos entéricos virais em amostras de água do mar

Abstract

A preocupação com a contaminação do ambiente aquático e, consequentemente, dos recursos hídricos, têm crescido devido a uma possível escassez da água potável no planeta. A contaminação das águas costeiras por vírus entéricos é causada pelo despejo de resíduos de origem fecal, afetando as águas utilizadas em atividades de recreação, pesca e no cultivo de moluscos bivalves, sendo responsável pela maioria dos surtos de gastroenterites que ocorrem no mundo. Indicadores bacterianos de contaminação fecal como os coliformes fecais, têm sido utilizados para o controle da qualidade das águas, porém já é estabelecido em todo o mundo que esta contaminação não está correlacionada com a presença de vírus entéricos. O desenvolvimento de novos métodos de concentração e detecção de vírus entéricos é uma alternativa para o controle da contaminação destas águas a fim de assegurar a qualidade de uso das mesmas. Os objetivos deste estudo foram: 1) Padronizar a metodologia de floculação utilizando leite desnatado acidificado na concentração de vírus em amostras de água do mar natural e artificial semeadas com quantidades conhecidas de adenovírus do sorotipo 2 (HAdV2). Comparar os resultados obtidos na recuperação viral com a metodologia já padronizada de filtração em membrana eletronegativa e reconcentração em Centriprep; 2) Aplicar metodologia padronizada na concentração e detecção de adenovírus humanos, poliomavírus cepa JC, vírus da hepatite A (HAV) e norovírus humano (HuNoV genogrupos GI e GII) em amostras de água do mar de 11 praias ao redor da Ilha de Santa Catarina, Florianópolis, Brasil durante um ano (Agosto de 2009 a Julho de 2010). 3) Analisar a presença de coliformes fecais (E. coli) e avaliar parâmetros físico-químicos, temperatura, pH, salinidade e oxigênio dissolvido. Para as detecções virais, o material genético das amostras foi extraído e diluído 1:10 para a redução de inibidores das reações enzimáticas. Nested-PCR qualitativo foi usado na detecção de HAdV e para a realização do sequenciamento. A detecção e quantificação de todos os vírus pesquisados foi realizada por PCR em tempo real. Os resultados da recuperação viral quando a metodologia de floculação foi empregada foram de 14% e 13,6% e no método de filtração, foram de 2,8% e 21% para as amostras de água do mar natural e artificial respectivamente. Das 132 amostras de campo analisadas, 16% foram positivas nas reações de nested-PCR para HAdV. Nas análises de PCR em tempo real, o vírus mais prevalente foi o HAdV, com 55% das amostras positivas, com intervalos de detecção de 8,40 x 103 a 1,9 x 107 CG/ L, seguido pelo HAV, com 51,5% de positividade, variando de 1,60 x 101 a 2,30 x 103 CG/ L. Para o JCPyV, 3% das amostras foram positivas, com intervalos de 1,90 x 104 a 1,70 x 105 CG/ L e para o NoV 7,5% e 4,5% das amostras foram positivas, com intervalos entre 2,41 x 103 a 5,14 x 106 e 3,73 x 104 a 2,10 x 106 CG/ L respectivamente para o GI e GII. As médias obtidas para os valores de coliformes fecais detectados foram de 8,0 a 1,325 UFC/100 mL em todos os pontos analisados. Somente dois dos pontos analisados não ultrapassaram o tolerável (Joaquina e Mole). Os demais pontos tiveram valores acima do permitido em algum mês do período analisado, destacando-se a Beira-Mar Norte com os valores mais elevados. As análises físico-químicas demonstraram valores concordantes com os previstos na legislação. O sequenciamento das amostras positivas para o HAdV demonstraram prevalência do adenovírus humano respiratório sorotipo 2. Os resultados obtidos evidenciam o destaque da contaminação viral nas amostras de água do mar e confirmam a não correlação da presença destes em relação à contaminação bacteriana. Este é o primeiro trabalho que avalia as condições das praias a redor da Ilha de Santa Catarina de forma mais abrangente, destacando diferentes tipos de contaminação.

The concern about aquatic environment contamination and consequently water resources is increasing mainly due to the warning about potable water scarcity in our planet. The contamination of coastal waters by enteric viruses is caused by discharge of residues of fecal origin, affecting waters used for recreational activities, fishing and shellfish growing, being responsible for most outbreaks of gastroenteritis occurring in the world. Bacterial indicators such as fecal coliforms have been used as parameters of water quality, however it has been clearly established worldwide that bacterial contamination show no relationship with the presence of human enteric viruses. The development of new methods of water concentration for enteric viruses detection is an alternative to monitor the contamination of these waters in order to ensure its quality.The objectives of this study were: 1) Standardize the methodology of flocculation using acidified skimmed milk for viral concentration in natural and artificial seawater samples previously spiked with known amounts of human adenoviruses serotype 2 (HAdV2). Results obtained with viral recovery were compared with the standardized methodology of water filtration in electronegative membrane and reconcentration by Centriprep#; 2) Apply standardized methodology in the concentration and detection of HAdV, poliomavirus (JCPyV), hepatitis A vírus (HAV) and noroviruses (HuNoV GI and GII) in seawater samples harvested in 11 different beaches in Santa Catarina Island, Florianópolis, Brazil in a period of one year (August 2009 to July 2010). Were also measured the presence of fecal coliform (E. coli) and physical-chemical parameters such as temperature, pH, salinity and dissolved oxygen. To reduce the presence of inhibitors of PCR reactions, a tenfold dilution of DNA/RNA of each sample was used. Nested-PCR was used for qualitative detection of HAdV and for conducting sequencing analysis. The detection and quantification of all the viruses evaluated was performed by real time PCR. The results of viral recovery by the standardized method of flocculation were 14% and 13.6% and for the filtration method, were 2.8% and 21% for samples of natural and artificial seawater respectively. From 132 field samples analyzed, 16% of these were positive for HAdV in the nested-PCR assay. In the analysis of real-time PCR, the most prevalent virus was HAdV, with 55% of positive samples with intervals of detection of 8.40 x 103 to 1.90 x 107 GC/ L, followed by HAV, with 51,5% of positivity, ranging from 2.30 x 101 to 1.60 x 103 GC/ L. For JCPyV, 3% of samples were positive, with ranges between 1.90 x 104 to 1.70 x 105 GC/ L and for NoV 7.5% and 4.5% of samples were positive, with intervals between 2.41 x 103 to 5.14 x 106 and 3.73 x 104 to 2.10 x 106 GC/ L respectively for GI and GII. The mean values of fecal coliforms detected were from 8.0 to 1.325 CFU/100 mL at all sites analyzed. Only two sites analyzed did not exceed the allowed by current legislation (Joaquina and Mole). The other sites showed, sometimes, values above the allowed during the period analyzed, with emphasis for Beira-Mar Norte site presenting the highest values. The physical-chemical analysis demonstrated values consistent with those recommended by legislation. The sequencing analysis of the samples positive for HAdV in qualitative PCR showed prevalence of human adenovirus respiratory serotype 2. The results show the highlight of viral contamination in the seawater samples and confirm the lack of correlation of their presence in relation to the bacterial contamination. This is the first study evaluating the conditions of the beaches around the Santa Catarina Island, highlighting different types of contamination.