|
Abstract:
|
O presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito do inibidor da metilação do DNA 5-Azacitidina (AzaC) na embriogênese somática em Acca sellowiana por meio de análises morfológicas e microscopia óptica, além de estudar os padrões de metilação do DNA global por meio da cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Embriões zigóticos de dois acessos de A. sellowiana (101X458 e 85) foram submetidos a quatro diferentes pulsos de 1h (200 µM de 2,4-D; 200 µM de 2,4-D e 10 µM de 5-AzaC; 10 µM de AzaC; e 100 µM de AzaC), seguidos da inoculação em meio de cultura LPm suplementado com maltose (30 g.L-1), vitamina de Morel, ácido glutâmico (8 mM) e Phytagel® (2 g.L-1), com diferentes concentrações de AzaC (0, 10 e 50 µM). Os embriões somáticos obtidos foram, após 50 dias de cultivo, inoculados em meio de conversão LPm suplementado com vitaminas de Morel, sacarose (30 g.L-1), BAP (0,5 µM), AG3 (1,0 µM) e carvão ativado (1,5 g.L-1). Paras as análises por HPLC amostras obtidas aos 10, 20 e 30 dias de cultivo foram submetidas à extração de DNA e posterior digestão de ácidos nucleicos, sendo detectados por meio de dois tipos de detecção diferentes: detector UV e espectrometria de massas (MS/MS). Os tratamentos isentos de 2,4-D apresentaram inibição da formação de embriões somáticos em ambos os acessos testados. O tratamento com suplementação de 10 µM de AzaC no meio de cultura e pulso de 2,4-D resultou na maior formação de embriões para o acesso 101X458, indicando médias de 19.6, 60 e 110.4 embriões somáticos, aos 20, 30 e 45 dias, respectivamente. Para o acesso 85, o tratamento com 50 µM de AzaC com pulso de 2,4-D resultou no maior número de embriões somáticos formados, indicando médias de 14.4, 364.4 e 484 embriões somáticos, aos 20, 30 e 45 dias, respectivamente. Para a conversão, foram obtidas taxas médias de conversão para plântulas de 35% para o acesso 101X458 e 30,2% para o acesso 85, e para o tratamento com pulso 200 uM 2,4-D/50 uM AzaC 16,6% e 8,9%, respectivamente. As análises dos nucleosídeos por HPLC/MS/MS se mostraram mais precisas e mais rápidas, realizando a separação dos compostos em 8 min, comparado a 25 min por HPLC/UV. Os dados obtidos por HPLC/MS/MS indicaram para as amostras do acesso 101X458 no tratamento com pulso 200 µM 2,4-D/0 uM AzaC um aumento crescente na metilação dos 10 aos 30 dias (34,7%, 40,9% e 44,3%, respectivamente). No tratamento com pulso 200 µM 2,4-D/50 µM AzaC observou-se uma queda nos níveis de metilação entre os 10 e 20 dias, seguido de uma alta (39,5%, 36,2% e 41,6%, respectivamente). Para o tratamento com pulso 100 µM AzaC/50 µM AzaC, observou-se uma queda nos três períodos de avaliação (36,8%, 28,8% e 20,8%, respectivamente). Para o acesso 85 o tratamento controle apresentou valores de 22,6%, 35,2% e 41% e o que continha AzaC e 2,4-D valores de 29,9%, 38,9% e 42,6%, sendo estes os tratamentos que estiveram associados à indução da ES. Por outro lado, o tratamento com AzaC, que não resultou na indução da ES, apresentou um padrão bastante distinto, com queda gradual nos níveis de metilação dos 10 aos 30 dias (37,6%, 24,7% e 21,5%). Os resultados obtidos indicam que o AzaC influencia positivamente a indução de embriões somáticos nesta espécie, contudo, o pulso de 2,4-D se mostrou essencial para este processo. Além disso, foi observado que a presença do AzaC no meio de cultura de indução parece prejudicar as taxas de conversão dos embriões somáticos a plântulas. Já os níveis de metilação parecem exercer um papel preponderante no processo de indução da ES em A. sellowiana. |
