Efeito da fração rica em proantocianidinas da planta croton celtidifolius sobre a neurotoxicidade glutamatérgica: um estudo in vitro e in vivo

Abstract

Glutamato, o principal neurotransmissor central excitatório, induz excitotoxicidade neuronal pela ativação de receptores NMDA e AMPA, promovendo o influxo de cálcio nos neurônios. Estudos recentes do nosso grupo demonstram que as frações e sub-frações isoladas da Croton celtidifolius possuem propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes e antinociceptivas. Assim, utilizando um modelo in vitro de excitotoxicidade induzida por glutamato (Glu) e in vivo de neurotoxicidade decorrente da lesão da medula espinhal de ratos Wistar adultos, avaliou-se o possível efeito neuroprotetor da fração rica (FRP) em proantocianidinas isolada da Croton celtidifolius. Glu induziu morte de células do gânglio da raiz dorsal (GRD), de forma dependente da concentração e do tempo de exposição. O pós-tratamento com a FRP (1 - 100 µg/ml) inibiu em até 37% a morte celular induzida por Glu (1 mM). Já o co-tratamento, foi capaz de reduzir a morte celular em 27%. A exposição das células ao Glu (0,01, 0,1 e 1 mM) aumentou os níveis da enzima lactato desidrogenase de 6,5 % (células controle) para 37, 49 e 63 %, respectivamente, indicativo de alteração na permeabilidade da membrana celular. Esta alteração foi atenuada pelo tratamento das células com a FRP (100 µg/mL). Ademais, o insulto glutamatérgico induziu a geração de espécies reativas de oxigênio, a qual foi inibida pelo tratamento das células do GRD com FRP (100 µg/ml). Além disso, o efeito neuroprotetor desencadeado pela FRP parece ser mediado em parte pela inibição de receptores glutamatérgicos do tipo NMDA, mas não os metabotrópicos uma vez que a perda da viabilidade celular decorrentes da exposição das células ao agonista NMDA, mas não ao agonista metabotrópico, foi revertida pela FRP. Nos estudos in vivo, animais submetidos a lesão medular e tratados com a FRP na dose de 10 mg/kg por via intraperitoneal, durante 5 dias consecutivos, apresentaram uma melhora significante na performance locomotora e na força de preensão, quando comparado aos animais lesados tratados com veículo. Em conjunto, estes resultados fornecem a primeira evidência de que a FRP atenua a morte celular por necrose e por apoptose, bem como a produção de EROs induzida por Glu, inibe a morte celular induzida por peróxido de hidrogênio e pelo agonista NMDA. A FRP também foi capaz de promover uma melhora na atividade locomotora e na força de preensão de animais submetidos à lesão traumática da medula espinhal, reforçando a hipótese de que polifenóis podem ser ferramentas terapêuticas promissoras como agentes neuroprotetores.

Glutamate, the major central excitatory neurotransmitter, induces neuronal excitotoxicity by activation of NMDA and AMPA receptors and stimulating the influx of calcium into neurons. Recently, our group showed that fractions and subfractions isolated from Croton celtidifolius have antiinflammatory, antioxidant and antinociceptive properties. Thus, using an in vitro model of excitotoxicity induced by glutamate (Glu) and in vivo neurotoxicity caused by spinal cord injury (SCI) in adult Wistar Rats, we evaluated the possible neuroprotective effect of a proanthocyanidin-rich fraction (PRF) isolated from the bark of Croton celtidifolius. Glu induced cell death of dorsal root ganglion (DRG) in a manner concentration-dependent and the exposure time. The post-treatment with FRP (from 1 to 100 ìg / mL) inhibited the cell death induced by Glu (1 mM) in 37%. Since co-treatment, was able to reduce cell death in 27%. The exposure of cells to glu (0.001, 0.1 and 1 mM) increased the levels of the enzyme lactate deydrogenase from 6.5% (control cells) to 37, 49 and 63% respectively, indicating changes in cell membrane permeability. This change was attenuated by treatment of cells with the PRF (100 ìg / mL). Moreover, the glutamatergic insult induced generation of reactive oxygen species, which was inhibited by treatment of cells with FRP (100 ìg / mL). Moreover, the neuroprotective effect triggered by FRP seems to be mediated in part by inhibition of NMDA-type glutamate receptors, but not metabotropic receptors, since the loss of cell viability after exposure of cells to NMDA agonist, but not a metabotropic agonist was reversed by FRP. The in vivo studies, animals subjected to SCI and treated with PRF at a dose of 10 mg / kg by i.p. route for 5 consecutive days showed a significant improvement in locomotor performance and grip force when compared to injured animals treated with vehicle. Taken together, these results provide the first evidence that PRF attenuated the cell death by apoptosis and the production of ROS induced by Glu, also inhibits cell death induced by hydrogen peroxide and the NMDA agonist receptors. The FRP was able to promote an improvement in locomotor activity and grip strength of animals subjected to traumatic spinal cord injury (SCI), reinforcing the hypothesis that polyphenols are promising therapeutic tools such as neuroprotective agents.