Análise proteômica do hipocampo de camundongo submetido ao tratamento com N-metil-D-aspartato (nmda) para indução de pré-condicionamento químico

Abstract

O pré-condicionamento induzido por N-metil-D-aspartato (NMDA) é uma poderosa ferramenta terapêutica contra insultos neuronais posteriores, por diversas razões: administração periférica, interação específica com receptores NMDA (NMDAR) e pelo quadro de neuroproteção gerado. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares envolvidos na geração do pré-condicionamento por NMDA no cérebro. A descoberta do mecanismo de sinalização celular gerado é crucial para delinear novas abordagens neuroprotetoras. Por essa razão, o objetivo deste trabalho foi investigar os possíveis mecanismos envolvidos no pré-condicionamento por NMDA utilizando uma abordagem proteômica para identificar proteínas expressas entre os camundongos pré-condicionados após 24h de administração de NMDA e após 1h e 72h de indução com NMDA (não protegidos). Ao grupo controle foi administrado solução salina (0,9% NaCl) e os demais grupos foram sacrificados após 1 hora, 24 horas ou 72 horas de administração com N-metil-D-aspartato (NMDA, 75mg/Kg de animal). O hipocampo de cada animal foi removido para extração das proteínas totais. Foram aplicados 250 mg / mL de proteína para análise em gel bidimensional (pI linear 3-10, gel SDS-PAGE 12,5%). Em seguida, os géis 2-DE foram corados com Coomassie Briliant Blue G-250 e analisados no programa Image Master 7.0 Platinum. A média de intensidade dos spots foram analisados (dados em % volume) entre os diferentes tempos de indução (1h, 24h e 72h). Foram encontradas seis proteínas com expressão diferencial significante com p <0,05 com base em ANOVA duas vias e Bonferroni pós-teste, sendo que quatro proteínas indicaram níveis de expressão elevada em 24h (proteína de choque térmico 70 kDa (HSP70), creatina cinase, aspatil-tRNA sintetase e proteína de ligação a fosfatidiletanolamina) e duas mostraram expressão diminuída (proteína de choque térmico 70 kDa (HSP70) e a proteína vacuolar V-ATPase). Além disso, a identificação e caracterização por espectometria de massa (MALDI-TOF) de 22 proteínas não alteradas mostrou-se útil, uma vez que essas proteínas desempenham funções celulares cruciais e também são necessárias para a geração da neuroproteção, entre essas se destacaram duas proteínas detectadas somente nos animais protegidos após 24h de administração com NMDA: subunidades alfa e beta da proteína de choque térmico 90 kDa (HSP90) e uma subunidade de HSP70. Todos esses resultados indicam que são necessárias diversas vias intracelulares associadas para mediar o pré-condicionamento e a neuroproteção. A identificação das proteínas relacionadas ao pré-condicionamento podem ajudar a elucidar os mecanismos celulares e moleculares de prevenção bem como na descoberta de novos alvos terapêutico por meio da determinação de uma janela de tempo mais efetiva nos tratamentos.