Efeitos do zinco sobre os sistemas de degradação de peróxidos de células neurais

Abstract

Zinco na sua forma ionica livre e mantido em concentracoes muito baixas nas celulas de mamiferos. Em algumas vesiculas sinapticas de neuronios glutamatergicos, porem, ele pode ser encontrado em altas concentracoes, aonde atua como um modulador ionico. Em situacoes patologicas, porem, o zinco livre pode se acumular no citosol nas celulas neurais provocando diversos efeitos toxicos, tais como a inibicao de enzimas. O zinco e capaz de inibir as enzimas antioxidantes gluationa redutase (GR) e tioredoxina redutase (TrxR), duas enzimas envolvidas na defesa celular contra oxidantes. Essa inibicao, portanto, pode resultar em um decrescimo na degradacao de peroxidos, levado a uma maior vulnerabilidade a danos oxidativos. O presente trabalho tem como objetivo investigar a relacao da inibicao das enzimas antioxidantes GR e TrxR, pela exposicao de celulas neurais ao zinco, com a susceptibilidade destas celulas quando desafiadas com agentes oxidativos. Celulas derivadas de neuroblastoma (N2a), astroglioma (C6) e fatias de hipocampo de ratos adultos foram pre-incubadas com 100 uM de ZnCl2 por 30 min, e em seguida expostas por uma hora a 100 uM de H2O2 ou 100 uM de peroxido de cumeno. O tratamento com ZnCl2 provocou uma queda na atividade da GR nos 3 modelos, sendo que as celulas C6 foram mais afetadas (77% de inibicao comparado com 30-35 % nos outros modelos). A enzima TrxR tambem foi inibida em 30% nas celulas C6, enquanto nas celulas N2a e fatias de hipocampo, esse efeito nao foi observado. O tratamento com ZnCl2 diminuiu a taxa de consumo de H2O2 e CHP nas celulas C6, enquanto nas celulas N2a somente o consumo de H2O2 foi afetado. Em celulas N2a, tanto o tratamento com ZnCl2 como com H2O2 provocaram uma diminuicao na viabilidade celular, porem a combinacao de ambos nao aumentou esta toxicidade. As celulas C6 foram resistentes aos efeitos toxicos dos peroxidos e ZnCl2, porem, o pre-tratamento com ZnCl2 aumentou a susceptibilidade dessas celulas a toxicidade de ambos os peroxidos, diminuindo a viabilidade, aumentando a permeabilidade celular e o dano ao DNA. O ZnCl2 nao aumentou a vulnerabilidade das fatias de hipocampo a toxicidade dos peroxidos, porem, quando estas foram expostas a 1 mM de H2O2, em combinacao com ZnCl2, houve queda na viabilidade celular na mesma proporcao causada pelo pre-tratamento com BCNU, um inibidor da GR. Neste caso, supoe-se que esta queda na viabilidade e devido a inibicao da GR. Em conclusao, os dados apresentados demonstram que, apesar da alta susceptibilidade das células neuronais (N2a) ao ZnCl2 e aos peróxidos, a inibição da GR não aumentou esta sensibilidade. Por outro lado, as células derivadas de astrócitos (C6) foram mais resistentes ao ZnCl2 e aos peróxidos, porém a inibição da GR e da TrxR pelo tratamento com zinco aumentaram a citotoxicidade de ambos os peróxidos. Nas células C6, o sinergismo entre a inibição das enzimas antioxidantes e a toxicidade aos peróxidos, provavelmente se deve a menor capacidade em degradar peróxidos. Desta forma, nosso dados indicam que a inibição de enzimas antioxidantes GR e TrxR é um fator importante associado a sua toxicidade em células neurais.

Zinc in its free, ionic form is kept in very low concentrations in mammalian cells. In some synaptic vesicles in glutamatergic neurons, however, it can be found in high concentrations where it acts as an ionic modulator. In pathological situations, however, this free zinc can accumulate in the cytosol of neural cells producing a myriad of toxic effects, such as the inhibition of enzymes. Zinc can inhibit glutathione reductase (GR) and thioredoxin reductase (TrxR), both antioxidant enzymes that are crucial for cell protection against oxidants. Therefore, a disturbance in the activity of these enzymes hinder peroxide degradation and increases vulnerability to oxidative damage. The present work aims to investigate the relation between the inhibition of these enzymes by zinc and the susceptibility of neuronal and astrocytic cells, as well as hippocampal slices, to H2O2 and cumene peroxide (CHP). Cells derived from neuroblastoma (N2a), astroglyoma (C6) and hippocampal slices were pre-incubated with 100 uM of ZnCl2 for 30 min, and then exposed to 100 uM of H2O2 or CHP for 1h. Treatment with ZnCl2 decreased GR activity in the three models, but this effect was higher in C6 cells (70 % of inhibition in comparison to 30-35 % of inhibition in the other models). TrxR was inhibited by 30 % in C6 cells, while in N2a and hippocampal slices this effect was not observed. Treatment with Zn decreased H2O2 and CHP consumption rate in C6 cells, but only H2O2 consumption rate was reduced in N2a cells. Both ZnCl2 and H2O2 treatment induced a decrease in cellular viability in N2a cells, but their combination did not enhance this toxicity. C6 cells were more resistant to toxic effects of ZnCl2 and peroxides, however, the preincubation with ZnCl2 increased cell vulnerability to both peroxides, decreasing cell viability, increasing membrane permeability and DNA damage. ZnCl2 did not increased vulnerability of hippocampal slices to toxic effects of peroxides, but when these cells were exposed to 1 mM of H2O2 after the ZnCl2 pre-treatment, a decrease in cell viability was observed in the same proportion as the effect caused by the pretreatment with BCNU, an inhibitor of GR, indicating that this effect is likely due to GR inhibition. In conclusion, this data demonstrate that despite the high susceptibility of N2a cells to ZnCl2 and H2O2, the zincinduced GR inhibition did not increased this vulnerability. In contrast, C6 cells were more resistant to ZnCl2 and peroxides, but the inhibition of GR and TrxR by zinc treatment highly increased the citotoxicity of both peroxides. Hippocampal slices were more resistant than the cell cultures to the toxic effects of the treatments, but when exposed to higher doses of H2O2, Zn was able to sensitize the cells to peroxide toxicity. In C6 cells, the synergism between the inhibition of enzymes and peroxide toxicity probably is related to the decreased capacity to metabolize peroxides. Therefore our data suggest that the inhibition of the antioxidant enzymes GR and TrxR by zinc is an important factor associated with its toxicity in neural cells.