Modelagem estrutural da PHA sintase de Chromobacterium violaceum para estudos de mutação sítio-dirigida

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Modelagem estrutural da PHA sintase de Chromobacterium violaceum para estudos de mutação sítio-dirigida

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dc.contributor Universidade Federal de Santa Catarina en
dc.contributor.advisor Porto, Luismar Marques en
dc.contributor.author Piemolini, Luciani Tatsch en
dc.date.accessioned 2013-07-15T22:37:57Z
dc.date.available 2013-07-15T22:37:57Z
dc.date.issued 2004
dc.date.submitted 2004 en
dc.identifier.other 222131 en
dc.identifier.uri http://repositorio.ufsc.br/handle/123456789/101555
dc.description Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química en
dc.description.abstract Uma classe de polímeros bacterianos que se destaca pela proximidade de suas características com as de plásticos de origem petroquímica são os polihidroxialcanoatos (PHA's). PHA sintases são enzimas chave para a biossíntese destes polímeros. A PHA sintase de Chromobacterium violaceum, que é do tipo I, utiliza como substrato hidroxiacil-CoA (HA-CoA) de 3 a 5 carbonos, enquanto a PHA sintase do tipo II de Pseudomonas aeruginosa, utiliza HA-CoA contendo de 6 a 14 carbonos. Com o objetivo de modificar a especificidade da PHA sintase de C. violaceum, buscou-se determinar sítios específicos para mutação, por técnica de DNA recombinante, de maneira a torná-la capaz da biossíntese de copolímeros contendo HA's de cadeia curta e média. O conhecimento da estrutura terciária, e particularmente, do sítio ativo da proteína, é uma etapa importante para o estudo de possibilidades de mudança de sua especificidade. Com base neste propósito, o modelo teórico para a PHA sintase de C. violaceum foi obtido através das técnicas de modelagem por homologia, utilizando-se uma lipase gástrica humana como referência (Depositada no PDB, Protein Data Bank, com o código de acesso 1HLG). O modelo foi desenvolvido baseado no alinhamento entre as seqüências primárias da PHA sintase de C. violaceum e P. aeruginosa, e a lipase, e validado através do gráfico de Ramachandran, apresentando 94% e 96% dos resíduos modelados com ângulos espacialmente possíveis, respectivamente para C. violaceum e P. aeruginosa. A estrutura 3D resultante apresenta uma díade catalítica composta pelos aminoácidos C292 e H478. O aminoácido D448, proposto como uma base geral catalítica que ativa o grupamento 3-hidroxil do HB-CoA para formar o intermediário tioéster pode, na verdade, ter o papel de auxiliar no transporte do substrato e na estabilização do estado de transição. Não foi possível confirmar que este faz parte de uma tríade catalítica, conforme sugerido na literatura. Os resultados obtidos pela modelagem da estrutura serviram de base para a escolha de mutações sítio-específicas, testadas neste trabalho. O gene phaCCv do genoma da C. violaceum (ATCC12472) foi amplificado por PCR, utilizando-se um par de oligonucleotídios complementares às extremidades 3' e 5' do gene phaC contendo sítios de restrições apropriados à ligação ao vetor. O plasmídio pBHR69 continha, além do gene de resistência à ampicilina, os genes phaA e phaB, codificando para a b-cetotiolase e acetoacil-CoA redutase de R. eutropha, respectivamente. O produto de PCR foi purificado e ligado ao pBHR69 previamente digerido com SmaI/BamHI; uma alíquota da reação de ligação foi utilizada para transformar as células competentes DHa5TM-TR. Os transformantes foram selecionados através da utilização de meio agar LB contendo ampicilina. A sintase de C. violaceum clonada e expressa em E. coli produziu PHB, e a diferença na produção de PHB pela PHA sintase não mutada e nos mutantes sugere uma possível mudança na afinidade enzima-substrato. en
dc.format.extent xii, 79 f.| il., grafs., tabs. en
dc.language.iso por en
dc.publisher Florianópolis, SC en
dc.subject.classification Engenharia quimica en
dc.subject.classification Bacterias en
dc.subject.classification Chromobacterium violaceum en
dc.subject.classification Biossintese en
dc.subject.classification Polimeros en
dc.subject.classification Polihidroxialcanoatos en
dc.subject.classification Sintese en
dc.title Modelagem estrutural da PHA sintase de Chromobacterium violaceum para estudos de mutação sítio-dirigida en
dc.type Dissertação (Mestrado) en
dc.contributor.advisor-co Antonio, Regina Vasconcellos en


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