Modelagem estrutural da PHA sintase de Chromobacterium violaceum para estudos de mutação sítio-dirigida

Abstract

Uma classe de polímeros bacterianos que se destaca pela proximidade de suas características com as de plásticos de origem petroquímica são os polihidroxialcanoatos (PHA's). PHA sintases são enzimas chave para a biossíntese destes polímeros. A PHA sintase de Chromobacterium violaceum, que é do tipo I, utiliza como substrato hidroxiacil-CoA (HA-CoA) de 3 a 5 carbonos, enquanto a PHA sintase do tipo II de Pseudomonas aeruginosa, utiliza HA-CoA contendo de 6 a 14 carbonos. Com o objetivo de modificar a especificidade da PHA sintase de C. violaceum, buscou-se determinar sítios específicos para mutação, por técnica de DNA recombinante, de maneira a torná-la capaz da biossíntese de copolímeros contendo HA's de cadeia curta e média. O conhecimento da estrutura terciária, e particularmente, do sítio ativo da proteína, é uma etapa importante para o estudo de possibilidades de mudança de sua especificidade. Com base neste propósito, o modelo teórico para a PHA sintase de C. violaceum foi obtido através das técnicas de modelagem por homologia, utilizando-se uma lipase gástrica humana como referência (Depositada no PDB, Protein Data Bank, com o código de acesso 1HLG). O modelo foi desenvolvido baseado no alinhamento entre as seqüências primárias da PHA sintase de C. violaceum e P. aeruginosa, e a lipase, e validado através do gráfico de Ramachandran, apresentando 94% e 96% dos resíduos modelados com ângulos espacialmente possíveis, respectivamente para C. violaceum e P. aeruginosa. A estrutura 3D resultante apresenta uma díade catalítica composta pelos aminoácidos C292 e H478. O aminoácido D448, proposto como uma base geral catalítica que ativa o grupamento 3-hidroxil do HB-CoA para formar o intermediário tioéster pode, na verdade, ter o papel de auxiliar no transporte do substrato e na estabilização do estado de transição. Não foi possível confirmar que este faz parte de uma tríade catalítica, conforme sugerido na literatura. Os resultados obtidos pela modelagem da estrutura serviram de base para a escolha de mutações sítio-específicas, testadas neste trabalho. O gene phaCCv do genoma da C. violaceum (ATCC12472) foi amplificado por PCR, utilizando-se um par de oligonucleotídios complementares às extremidades 3' e 5' do gene phaC contendo sítios de restrições apropriados à ligação ao vetor. O plasmídio pBHR69 continha, além do gene de resistência à ampicilina, os genes phaA e phaB, codificando para a b-cetotiolase e acetoacil-CoA redutase de R. eutropha, respectivamente. O produto de PCR foi purificado e ligado ao pBHR69 previamente digerido com SmaI/BamHI; uma alíquota da reação de ligação foi utilizada para transformar as células competentes DHa5TM-TR. Os transformantes foram selecionados através da utilização de meio agar LB contendo ampicilina. A sintase de C. violaceum clonada e expressa em E. coli produziu PHB, e a diferença na produção de PHB pela PHA sintase não mutada e nos mutantes sugere uma possível mudança na afinidade enzima-substrato.