Avaliação da Anexina-V e Calceína-AM como marcadores de apoptose em linfócitos

Abstract

A avaliação dos níveis de apoptose por citometria de fluxo é geralmente realizada por métodos que utilizam anexina V-FITC como marcador vital, que se associa aos resíduos de fosfatidilserina, externalizados no início do processo apoptótico. A utilização conjunta do marcador nuclear fluorescente iodeto de propídio (PI), por sua vez, torna possível verificar as alterações nucleares características dos estágios tardios da apoptose, como resultado do aumento da permeabilidade de membrana. Por outro lado, a utilização de calceína AM e homodímero de etídio (EthD-1) permite a verificação da apoptose através da detecção da diminuição de atividade esterásica intracelular e alterações físico-químicas na membrana celular, através do EthD-1, que combina-se à cromatina à medida que esta se torna condensada. O objetivo deste trabalho foi avaliar e comparar a sensibilidade na avaliação precoce da apoptose dos métodos que utilizam calceína AM e homodímero de etídio aqueles que utilizam anexina V FITC e iodeto de propídio, tomado como método de referência, a partir da marcação de células mononucleares periféricas de pacientes infectados pelo vírus da imunodeficiência adquirida (HIV). As análises por citometria de fluxo foram realizadas após os períodos de incubação de 24 e 48 horas em meio RPMI 1640. Os resultados demonstraram que a metodologia que utiliza calceína AM/ homodímero de etídio apresentou-se mais sensível na quantificação das células apoptóticas em ambos períodos de incubação (Média 46,95% ± 3,56, p<0,0001, para 24 horas e Média 37,67% ± 2,47, p<0,0014 para 48 horas), além de permitir definir com clareza as populações de células viáveis, em apoptose e inviáveis. Tendo em vista que a regulação anormal do processo de morte celular por apoptose está envolvida na patogênese de diversas desordens, incluindo a progressão da infecção pelo HIV, o emprego de metodologias sensíveis de avaliação desse processo, como a calceína AM-EthD-1, pode resultar em importante mecanismo de acompanhamento da progressão de doenças.