Avaliação das células do sistema imune circulantes e de citocinas plasmáticas de pacientes com cirrose hepática

Abstract

A cirrose é consequência de uma agressão hepática crônica. Durante a progressão da doença, existe um desequilíbrio importante no sistema imune, denominado disfunção imune associada à cirrose (DIAC). Os objetivos deste estudo foram desenvolver e validar um painel de oito cores de anticorpos monoclonais para detectar e analisar as células do sistema imune circulantes de pacientes com cirrose hepática e avaliar as concentrações de citocinas plasmáticas nesse grupo de indivíduos. Para isso, foram incluídos pacientes com descompensação aguda (DA) da cirrose hospitalizados na Emergência do Hospital Universitário da Universidade Federal de Santa Catarina (HU UFSC), pacientes com cirrose estável (CE) em acompanhamento ambulatorial e controles saudáveis (CS). Amostras de sangue periférico com o anticoagulante EDTA/K3 foram processadas e os equipamentos FACS Canto II e XE 2100 foram utilizados. A dosagem de citocinas plasmáticas foi realizada pelo kit BD? Cytometric Bead Array (CBA). Os resultados foram comparados a dados clínicos e laboratoriais. Valores de p = 0,05 foram considerados significativos. Depois de desenvolvido e validado, o painel de anticorpos monoclonais foi utilizado para avaliar as células do sistema imune circulantes de 39 pacientes DA, 29 pacientes CE e 30 CS. Os pacientes cirróticos diferem dos CS por apresentarem linfopenia importante e uma razão de células T CD4+/ T CD8+ aumentada. No compartimento de células B, observou-se a presença de maiores quantidades de células B naïve e menores de B de memória CD27+. Foram observadas maiores porcentagens de monócitos CD62L+ e menor expressão de HLA-DR na superfície dos monócitos clássicos (cMo). Concentrações mais elevadas de IL-6 e IL-10 foram encontradas em pacientes cirróticos. Quando os pacientes cirróticos foram comparados, o grupo DA apresentou maiores porcentagens de neutrófilos e de neutrófilos imaturos, além de linfopenia pronunciada. Dentre os linfócitos T, houve aumento de células T CD8+ efetoras terminais e de células T regulatórias de memória. Além disso, houve aumento de cMo e diminuição de células dendríticas (DCs) circulantes. Dentro do compartimento B, o grupo DA apresentou maiores porcentagens de células B class-switched (CS) CD27neg e de plasmablastos. Hepatopatia avançada e complicações clínicas foram associadas a alterações nos subtipos de células B (maior quantidade de células de memória) e de monócitos (aumento de cMo), além de diminuição importante de DCs. A síndrome ACLF foi associada ao aumento de neutrófilos, de células B CS, de IL-6 e de IL-10; e à diminuição de DCs. Pela análise de regressão logística, os parâmetros IL-10, células B CS e CS CD27neg foram independentemente associados à ACLF. No ponto de corte de 4,7%, as células CS CD27neg foram capazes de predizer ACLF. A análise da probabilidade de sobrevivência de Kaplan-Meier dos pacientes do grupo DA mostrou que, dentro do compartimento monocítico, as porcentagens de cMo maiores que 90%, de monócitos intermediários (iMo) menores ou iguais a 5,7%, e de macrógafos tissulares (TiMas) menores que 8,6% foram capazes de predizer mortalidade em 90 dias. Enquanto que porcentagens de células B transicionais, dentro do compartimento B, menores que 1,3% foram capazes de predizer mortalidade em 365 dias. Pela análise dos resultados do presente estudo, é possível concluir que células circulantes e citocinas de pacientes com cirrose estão alteradas quando comparados a indivíduos saudáveis, e que essas alterações apresentam fenótipos distintos em pacientes com doença estável e avançada. A compreensão da deficiência imunológica da cirrose hepática e a detecção de biomarcadores podem permitir o desenvolvimento de melhores abordagens terapêuticas e a detecção de pacientes que provavelmente se beneficiariam de imunoterapia.

Abstract: Liver cirrhosis is caused by chronic liver injury. The condition may lead to an imbalance of the immune system called cirrhosis-associated immune dysfunction (CAID). The aim of this study was to design and validate an eight-color panel to detect and analyze the immune cells of patients with cirrhosis, and to evaluate pro and anti-inflammatory cytokines levels. This study included 39 consecutive adult patients with acute decompensation (AD) of cirrhosis hospitalized at the University Hospital of the Federal University of Santa Catarina, cirrhotic patients with stable disease (SC), and healthy controls (HC). Whole blood samples collected with EDTA/K3 were processed and analyzed by FACS Canto II and XE 2100 equipments. Moreover, the measurement of plasma cytokine levels was performed using the BD? Cytometric Bead Array (CBA) kit. All the results acquired in this study were correlated with clinical and laboratorial variables. P values = 0.05 were considered of statistical significance. The eight-color antibody panel was used to evaluate the imune cells of a total of 39 AD, 29 SC, and 30 HC. Cirrhotic patients differ from HC due to significant lymphopenia, and an increased T CD4+/ TCD8+ ratio. Considering B cells, both SC and AD groups had higher percentages of naïve B cells and lower frequencies of CD27+ memory B cells than the control. Besides that, cirrhotic patients had more CD62L+ monocytes and their classical monocytes (cMo) express lower levels of HLA-DR. Higher levels of IL-6 and IL-10 were detected in both SC and AD groups. When cirrhotic patients were compared, the AD group presented higher quantities of neutrophils and immature neutrophils, and a profound lymphopenia. Considering T cells, AD had more terminal effector T CD8+ cells and an important increase in memory T regulatory cells. Moreover, AD had more cMo and less dendritic cells (DCs) than SC. Considering B cells, AD presented higher percentages of class-switched (CS) CD27neg B cells and plasmablasts. Advanced liver disease and clinical complications were associated with alterations in B cells (more memory B cells) and in monocytes (more cMo), besides with lower DCs counts. ACLF syndrome was associated with an increase in neutrophils, in CS B cells, in IL-6 and IL-10, and with a reduction of DCs. Logistic regression analysis showed that IL-10, B cells CS and CS CD27neg were independently associated with ACLF. At the cutoff of 4.7%, CS CD27neg were able to predict ACLF. The analysis of the Kaplan-Meier survival probability of AD patients showed that, within monocyte compartment, the percentages of cMo greater than 90%, intermediate monocytes (iMo) equal to or lower than 5.7%, and tissular macrophagues (TiMas) lower than 8.6% were able to predict mortality in 90 days. While percentages of transitional B cells, within B-cell compartment, lower than 1.3% were able to predict mortality within 365 days. Through the analysis of the results of the present study, it is possible to conclude that circulating cells and cytokines of patients with cirrhosis are altered when compared to healthy individuals, and that these alterations show different phenotypes in patients with stable and advanced disease. The understanding of the immune deficiency of liver cirrhosis and the detection of useful biomarkers may allow the development of improved therapeutic approaches and the detection of patients that most likely would benefit from immunotherapy.