Efeitos neurotóxicos do piriproxifeno em mitocôndrias e em parâmetros de estresse oxidativo durante o desenvolvimento embrionário

Abstract

O piriproxifeno (PPF) é um larvicida a base de piridina que atua interrompendo o desenvolvimento larval de insetos. No Brasil, a utilização do PPF em reservatórios de água potável para controle de mosquitos do gênero Aedes, vetor de doenças, é permitida desde o ano de 2014. Porém, em 2015, o aumento dos casos de microcefalia em recém-nascidos no país gerou a hipótese de que o PPF poderia ser uma das causas dessa anomalia congênita. Embora o Zika vírus tenha sido associado ao aumento de casos de microcefalia, a toxicidade do PPF não foi descartada. A formação do sistema nervoso central (SNC) depende de um complexo sistema de sinalizações celulares e moleculares que envolvem organelas centrais, como as mitocôndrias, que são organelas multifuncionais envolvidas na neurulação e na neurogênese. Porém, a ultraestrutura e a dinâmica mitocondrial podem ser afetadas frente a exposição a xenobióticos, como o PPF, contribuindo para o aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e estresse oxidativo. Com o objetivo de investigar os efeitos neurotóxicos do PPF durante o desenvolvimento embrionário de vertebrados não-alvo, este trabalho avaliou danos na ultraestrutura mitocondrial, alterações na dinâmica mitocondrial e em parâmetros de estresse oxidativo. Para tal, foram estabelecidos os seguintes grupos experimentais: o grupo controle (DMSO 1% diluído em solução salina, veículo; 0 mg/L de PPF), o grupo exposto a 0,01 mg/L de PPF, e o grupo exposto a 10 mg/L de PPF. A exposição ao PPF foi realizada in ovo após 24 h de incubação, que corresponde à idade embrionária (E1), sendo os embriões analisados em E10. Adicionalmente, para avaliar os parâmetros antioxidantes foram definidos três períodos de exposição, nos quais o PPF foi administrado em E3, E8 e E9, cada um com um grupo controle e um grupo exposto a 10 mg/L de PPF. Inicialmente, as análises da ultraestrutura mitocondrial mostraram aumento no número de mitocôndrias alteradas e danos irreversíveis na ultraestrutura mitocondrial. A análise da dinâmica mitocondrial mostrou aumento na imunomarcação das proteínas Mfn1 e Drp1 envolvidas respectivamente, nos processos de fusão e fissão mitocondrial. Os parâmetros de estresse oxidativo mostraram a redução da atividade de GPx e aumento nos níveis de NPSH na exposição de E8-E10. A avaliação de danos oxidativos ao DNA mostrou um aumento nas duas concentrações de PPF utilizadas neste estudo. Os resultados demonstraram que a exposição ao PPF pode induzir danos na ultraestrutura mitocondrial, levando a alterações na dinâmica mitocondrial, perda da capacidade antioxidante, e danos oxidativos ao DNA durante o neurodesenvolvimento. Dessa forma, este estudo destaca a capacidade do PPF de afetar a ultraestrutura e a dinâmica mitocondrial. Estes efeitos, juntamente com os danos ao DNA, podem prejudicar o crescimento e o desenvolvimento do encéfalo em organismos não-alvo.

Abstract: Pyriproxyfen (PPF) is a pyridine-based larvicide that acts by interrupting the larval development of insects. In Brazil, the use of PPF in drinking water reservoirs to control mosquitoes of the Aedes genus, a vector of diseases, has been permitted since 2014. However, in 2015, the increase in cases of microcephaly in newborns in the country led to the hypothesis that PPF could be one of the causes of this congenital malformation. Although the Zika virus has been associated with the increase in cases of microcephaly, the toxicity of PPF has not been ruled out. The formation of the central nervous system (CNS) depends on a complex system of cellular and molecular signaling involving central organelles, such as mitochondria, which are multifunctional organelles involved in neurulation and neurogenesis. However, mitochondrial ultrastructure and dynamics may be affected by exposure to xenobiotics, such as PPF, contributing to increased production of reactive oxygen species (ROS) and oxidative stress. Aiming to investigate the neurotoxic effects of PPF during embryonic development of non-target vertebrates, this study evaluated damage to mitochondrial ultrastructure, changes in mitochondrial dynamics and oxidative stress parameters. For this purpose, the following experimental groups were established: the control group (1% DMSO diluted in saline solution, vehicle; 0 mg/L of PPF), the group exposed to 0.01 mg/L of PPF, and the group exposed to 10 mg/L of PPF. Exposure to PPF was performed in ovo after 24 h of incubation, which corresponds to embryonic age (E1), and the embryos were analyzed at E10. Additionally, to evaluate the antioxidant parameters, three exposure periods were defined, in which PPF was administered at E3, E8 and E9, each with a control group and a group exposed to 10 mg/L of PPF. Initially, the analyses of mitochondrial ultrastructure showed an increase in the number of altered mitochondria and irreversible damage to the mitochondrial ultrastructure. The analysis of mitochondrial dynamics showed an increase in the immunostaining of the Mfn1 and Drp1 proteins involved, respectively, in the mitochondrial fusion and fission processes. The oxidative stress parameters showed a reduction in GPx activity and an increase in NPSH levels in the E8-E10 exposure. The evaluation of oxidative damage to DNA showed an increase in the two concentrations of PPF used in this study. The results demonstrated that exposure to PPF can induce damage to the mitochondrial ultrastructure, leading to changes in mitochondrial dynamics, loss of antioxidant capacity, and oxidative damage to DNA during neurodevelopment. Therefore, this study highlights the ability of PPF to affect mitochondrial ultrastructure and dynamics. These effects, together with DNA damage, may impair brain growth and development in non-target organisms.