Validação e implementação de microdissecção a laser para separação de amostras masculinas na rotina forense

Abstract

A violência sexual é um crime universal, definido como todo ato sexual não desejado, ou ações de comercialização e / ou utilização da sexualidade de uma pessoa mediante qualquer tipo de coerção. Cabe à perícia criminal utilizar recursos técnico-científicos para elucidar a materialidade e a autoria do crime, em especial, por meio do exame de DNA. Para tanto, os laboratórios forenses não medem esforços para a obtenção de perfis genéticos informativos e de alto valor probatório, entretanto, pelo fato dos suabes íntimos constituírem misturas complexas de DNA, isto nem sempre é possível. Assim, novas metodologias vêm sendo testadas na área forense com o intuito de otimizar a obtenção dos perfis genéticos de vítima e agressor, em uma mesma amostra. A microdissecção a laser (LMD) é um método inovador na separação celular, que combina a microscopia óptica com a tecnologia do laser, permitindo a separação de células ou regiões alvo específicas em uma amostra. O presente estudo avaliou o uso da LMD como método de separação celular para a análise de marcadores genéticos autossômicos do tipo microssatélites em amostras de fonte única masculina e misturas simuladas, por meio de dois protocolos de extração de DNA. Foi realizado ainda, o processamento de cinco casos forenses de crimes sexuais por meio da técnica. Os resultados dos testes em amostras de fonte única demonstraram a efetividade da LMD na obtenção de perfil genético pela captura de 50, 100 e 200 espermatozoides em protocolo de amplificação direta e 200 espermatozoides para o protocolo de extração em fase sólida. O protocolo de extração direta apresentou ainda, melhor desempenho nos parâmetros de recuperação de alelos, intensidade média do sinal dos picos e balanço entre os picos heterozigotos. Os testes com misturas simuladas demonstraram o potencial da técnica na separação celular, uma vez que todos os grupos, independente do protocolo de extração e quantidade de células capturadas, geraram perfis únicos masculinos na análise de marcadores autossômicos. Nos casos forenses, duas amostras de suabe vaginal previamente submetidas à extração diferencial, sem sucesso de amplificação na fração espermática, geraram perfis únicos informativos após a captura de 127 e 201 espermatozoides. O processamento de duas amostras de suabes íntimos armazenados há mais de 10 anos foi capaz de gerar perfis únicos informativos pela captura de 117 e 121 espermatozoides. Por fim, uma amostra de suabe vaginal foi capaz de gerar perfil informativo após a captura de apenas 42 células, quando aplicados parâmetros analíticos (limiar analítico de 50RFU) comumente utilizados na interpretação de eletroferogramas de amostras de gametas submetidas à LMD. A perícia criminal deve estar munida dos mais modernos recursos a fim de produzir provas incontestes da materialidade e autoria dos crimes de violência sexual. Assim, são fundamentais o conhecimento e a disseminação das técnicas disponíveis para a obtenção de perfis genéticos de fácil interpretação e alto valor probatório em casos de crimes sexuais.

Abstract: Sexual violence is a universal crime, defined as any unwanted sexual act, or the commercialization and/or exploitation of a person's sexuality through any form of coercion. Forensic scientists uses technical-scientific means to clarify the materiality of this crime and, above all, its authorship, through DNA testing. To this end, forensic laboratories spare no effort to obtain informative genetic profiles with a high evidentiary value, witch is not always possible since intimate swabs may generate complex mixtures of DNA. Therefore, new methods have been tested in forensic comunite to obtain genetic profiles of the victim and the perpetrator in a unique sample. Laser microdissection (LMD) is an innovative method of cell separation that combines light microscopy with laser technology, allowing the separation of specific cells or tissue regions. The present study evaluated the use of LMD as a cell separation method for the analysis of autosomal genetic markers in sperm samples and mock mixture samples using two DNA extraction protocols. Five forensic sex crime cases were also processed. The results of the single source sample tests demonstrated the effectiveness of the LMD in obtaining a genetic profile by capturing 50, 100, and 200 spermatozoa using the direct amplification protocol and 200 spermatozoa using the solid phase extraction protocol. The direct amplification protocol also showed better performance in terms of allele recovery, mean peak signal intensity, and balance between heterozygous peaks. Tests with mock mixture samples demonstrated the potential of the technique in cell separation, as all groups, regardless of the extraction protocol and the amount of captured cells, generated unique male profiles in the autosomal genetic markers analysis. There was no change in PHR in samples from slides with simulated mixtures compared to samples from the male-only source. In forensic cases, two vaginal swab samples previously subjected to differential extraction without successful sperm fraction amplification produced an informative profile after capturing 127 and 201 spermatozoa. Processing of two intimate swab samples stored for more than 10 years was able to generate informative male profiles by capturing 117 and 121 spermatozoa. Additionally, a vaginal swab sample was able to generate an informative profile after the capture of only 42 cells when applying analytical parameters (50RFU as analytical threshold) commonly used in the interpretation of electropherograms of gamete samples submitted to LMD. Forensic science needs to be equipped with the most advanced tools to provide incontrovertible evidence of the materiality and authorship of sexual assault cases. Therefore, the knowledge and dissemination of available techniques for obtaining genetic profiles that are easy to interpret and have high probative value in cases of sexual crimes are essential.