Desenvolvimento de nanopartículas híbridas para o encapsulamento de IR-780 visando aplicações em terapia fototérmica e fotodinâmica

Abstract

Terapias emergentes como a Terapia Fotodinâmica (TFD) e a Terapia Fototérmica (TFT) têm se destacado como abordagens promissoras na oncologia moderna, especialmente por sua seletividade e caráter minimamente invasivo. Ambas se baseiam na ativação de um fotossensibilizador (FS) por luz com comprimento de onda adequado. No caso da TFD, a presença de oxigênio molecular é crucial. A ativação do FS gera espécies reativas de oxigênio (ROS), que são altamente citotóxicas, levando à lesão e morte celular. Já a TFT foca na geração de calor localizado, também induzida pela ativação do FS, que causa hipertermia e, consequentemente, a destruição das células-alvo. Esses mecanismos distintos, porém complementares, abrem novas perspectivas para o tratamento de diversas condições. O corante heptametina IR-780 é um FS promissor por absorver na região do infravermelho próximo (NIR), penetrar tecidos mais profundamente e apresentar afinidade mitocondrial. Entretanto, sua hidrofobicidade e instabilidade limitam sua aplicação clínica. Visando superar essas limitações, o presente trabalho propôs a formulação de nanopartículas híbridas formadas por micelas do copolímero em bloco Pluronic® F127 recobertas com quitosana (QT) e derivados modificados, incluindo a N,N,N-trimetilquitosana (TMC) e TMC folatada (TMC-Fol), com funcionalização via EDC/NHS com ácido fólico (FA), objetivando aplicações em TFD e TFT com entrega ativa e seletiva. As nanopartículas foram obtidas por automicelização do copolímero F127, empregando os métodos de adição direta ou dispersão sólida e recobertas em pH fisiológico. Para a otimização da formulação, utilizou-se o planejamento experimental Box Behnken, considerando como fatores as concentrações de F127, da TMC e do FA. A concentração do IR-780 foi mantida constante em todas as amostras. As variáveis de resposta avaliadas foram o diâmetro hidrodinâmico (Dh), o índice de polidispersão (PDI) e o potencial zeta (?), determinados por espalhamento dinâmico de luz. Com base na análise dos parâmetros experimentais e do índice de desejabilidade (D), a condição ótima determinada correspondeu à formulação contendo 2,0% (m/v) de F127, 1,0 mg/mL de TMC e 0,4 mg/mL de FA, preparada pelo método de dispersão sólida. A validação experimental confirmou a previsibilidade do modelo, não sendo observadas diferenças estatisticamente significativas entre os valores obtidos e os preditos para PDI e potencial zeta, conforme análise pelo teste t para uma média de referência e teste de Levene para homogeneidade de variâncias (p > 0,05). Adicionalmente, a formulação otimizada foi aplicada, para fins comparativos, às amostras contendo QT ou TMC-Fol. Na sequência, todas as amostras obtidas foram caracterizadas por microscopia eletrônica de transmissão (MET), eficiência de encapsulamento, espectroscopias de UV-Vis e fluorescência. A eficiência de encapsulamento foi de aproximadamente 100% para todas a formulações. As imagens de MET mostraram morfologia esférica com distribuição adequada para acúmulo tumoral passivo por efeito EPR. Além disso, as análises de estabilidade acelerada realizadas por Lumisizer® mostram baixos índices de desestabilização e um período mínimo de prateleira de seis meses. A alta eficiência de incorporação e os dados de supressão de fluorescência indicaram que o IR-780 se encontra em diferentes ambientes de incorporação no interior das nanoestruturas (duas populações). O IR-780 apresentou ainda elevados valores de coeficiente de absortividade molar em todos os meios (homogêneos e heterogêneos), propriedade crucial para a TFD e TFT. O sistema F127/TMC/FA foi aquele que melhor favoreceu a fluorescência do IR-780. Com relação à eficiência fototérmica, todas as amostras apresentaram expressiva geração de calor empregando-se a técnica de espectroscopia por Lentes Térmicas (LT). Assim, as amostras obtidas apresentaram-se promissoras para o desenvolvimento de formulações aplicáveis em TFD e TFT.

Abstract: Emerging therapies such as Photodynamic Therapy (PDT) and Photothermal Therapy (PTT) have gained prominence as promising approaches in modern oncology, particularly due to their selectivity and minimally invasive nature. Both rely on the activation of a photosensitizer (PS) by light of an appropriate wavelength. In the case of PDT, the presence of molecular oxygen is essential. Upon activation, the PS generates reactive oxygen species (ROS), which are highly cytotoxic and lead to cellular damage and death. In contrast, PTT focuses on the localized generation of heat, also triggered by PS activation, which induces hyperthermia and subsequent destruction of target cells. These distinct yet complementary mechanisms open new perspectives for the treatment of a wide range of pathological conditions. The heptamethine dye IR-780 has shown promise as a PS due to its near-infrared (NIR) absorption, enhanced tissue penetration, and mitochondrial affinity. However, its clinical application is hindered by poor water solubility and chemical instability. To overcome these limitations, the present work proposed the development of hybrid nanoparticles based on Pluronic® F127 block copolymer micelles coated with chitosan (QT) or modified derivatives, including N,N,N-trimethyl chitosan (TMC) and folate-conjugated TMC (TMC-Fol), via EDC/NHS-mediated conjugation with folic acid (FA), aiming for actively targeted and selective delivery for PDT and PTT applications. Nanoparticles were obtained by spontaneous micellization of the Pluronic® F127 triblock copolymer, using either direct addition or solid dispersion methods, coated at physiological pH and subsequently characterized. For formulation optimization, a Box-Behnken design was applied, with F127, TMC, and FA concentrations as independent variables. The IR-780 concentration was kept constant in all samples. The dependent variables analyzed were hydrodynamic diameter (Dh), polydispersity index (PDI), and zeta potential (?), determined by dynamic light scattering (DLS). Based on experimental parameters and the desirability index (I), the optimized formulation consisted of 2.0% (w/v) F127, 1.0 mg/mL TMC, and 0.4 mg/mL FA, prepared by the solid dispersion method. Experimental validation confirmed the predictability of the model, with no statistically significant differences between predicted and observed values for PDI and zeta potential, as determined by one-sample t-tests and Levene?s test for homogeneity of variances (p > 0.05). Additionally, the optimized formulation was applied to samples containing only QT or TMC-Fol for comparative purposes. All formulations were further characterized by transmission electron microscopy (TEM), encapsulation efficiency, UV-Vis and fluorescence spectroscopy. Encapsulation efficiency was approximately 100% for all formulations. TEM images revealed spherical morphology with diameters below 100 nm, appropriate for passive tumor accumulation via the enhanced permeability and retention (EPR) effect. Accelerated stability studies using the Lumisizer® showed low destabilization indices and a minimum shelf-life of six months. High encapsulation efficiency and fluorescence quenching data suggested the presence of two distinct populations of IR-780 molecules, indicating incorporation into different microenvironments within the nanostructures. IR-780 also exhibited high molar absorptivity across all media (homogeneous and heterogeneous), a key feature for both PDT and PTT. The F127/TMC/FA system best preserved IR-780 fluorescence. Regarding photothermal efficiency, all samples demonstrated significant heat generation, as measured by thermal lens (TL) spectroscopy, with the TMC-Fol formulation producing twice as much heat as the others. Thus, the developed formulations proved to be promising candidates for further application in PDT and PTT.