Resultados preliminares da aplicabilidade de propídio monoazida e sequenciamento do DNA para identificação de bactérias viáveis em leite UHT

Abstract

Doenças transmitidas por alimentos representam um grave problema de saúde pública. Bactérias patogênicas vinculadas a alimentos como Salmonella spp. Escherichia coli e Staphylococcus aureus são comumente associadas a casos de toxinfecções. Métodos para a identificação e quantificação de microrganismos em alimentos normalmente são baseados em métodos cultivo dependentes, os quais possuem procedimentos trabalhosos e muitas vezes demorados, prejudicando a rápida liberação dos resultados. Além disso, métodos cultivo dependentes não possuem a capacidade de detectar células no estado viável, mas não cultivável (VBNC). Como maneira de contornar esse problema métodos cultivo independentes foram desenvolvidos. Muitas dessas técnicas são baseadas na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), bem como métodos de sequenciamento do DNA, que permitem maior acurácia na determinação e identificação dos micro-organismos em diferentes matrizes. Porém, essas técnicas não podem diferenciar entre células viáveis e não viáveis. Após estudos viu-se a possibilidade da utilização de corantes fotorreativos como o Propídio monoazida (PMA), que são capazes de intercalar ao DNA das células mortas fazendo com que ele não possa ser amplificado. Diante disso, o objetivo deste trabalho é a avaliação do uso do Propídio monoazida (PMAxx) associado ao sequenciamento de DNA para identificação de células viáveis de Salmonella Thyphimurium, Staphylococcus aureus e Escherichia coli no leite UHT integral. Amostras de leite UHT foram contaminadas com suspensões bacterianas contendo células vivas, células mortas e células 80% mortas e 20% vivas, em concentrações variando de 2 Log UFC/mL a 5 Log UFC/mL, tratadas e não tratadas com PMAxx, para posterior sequenciamento de DNA. Primeiramente, dois tampões de lise foram avaliados para se determinar o mais adequado para este tipo de matriz, sendo que o método que utiliza o Neozol foi aquele com resultados mais adequados. Duas concentrações de PMAxx foram utilizadas e os resultados demonstraram que a concentração de 50 μM de PMAxx foi mais efetiva quando comparada com a concentração de 25 μM no tratamento das amostras contaminadas com suspensões bacterianas de células mortas. Entretanto, foi observado que o uso de 50 μM de PMAxx nas amostras com 2 Log UFC/mL de células vivas de S. Thyphimurium e E. coli, teve efeito citotóxico, sendo que, para as células vivas de S. aureus esse efeito foi mais acentuado nas concentrações celulares de 2 Log UFC/mL a 4 UFC/mL. Nas amostras contaminadas com mistura de células vivas e mortas, S. aureus não foi sequenciada em nenhuma das concentrações, E. coli apenas na concentração de Log 5 UFC/mL e S. Thyphimurium foi sequenciada em todas as concentrações. Contudo, seriam necessárias maiores concentrações de PMAxx nas células mortas de S. Thyphimurium, pois as mesmas tiveram seu DNA sequenciado em todas as concentrações celulares. Além disso, o sequenciamento de DNA se mostrou um método completo e eficiente para amostras complexas e de alta diversidade bacteriana como o leite. A partir dos resultados obtidos pode-se sugerir que o tratamento de amostras com PMAxx para identificação de bactérias viáveis em alimentos através do sequenciamento de DNA é um método promissor e que deve continuar a ser avaliado. Sugere-se, desta forma, a avaliação e optimização da concentração de PMAxx, tempo de encubação e de exposição a luz, bem como aplicação a diferentes matrizes alimentares e bactérias patogênicas.

Foodborne diseases represent a serious public health problem. Foodborne pathogens such as Salmonella spp. Escherichia coli and Staphylococcus aureus are commonly associated with cases of toxinfections. Methods for the identification and quantification of microorganisms in foods are usually based on culture dependent methods, which have laborious and often timeconsuming procedures, hindering the rapid release of results. Also, culture dependent methods cannot detect cells in the viable but non-culturable state (VBNC). As an alternative for those problems, culture independent methods have been developed. Many of these techniques are based on Polymerase Chain Reaction (PCR), as well as DNA sequencing methods, which allow greater accuracy in the determination and identification of microorganisms in different matrices. However, these techniques cannot differentiate between viable and nonviable cells. Studies have shown that photo-reactive dyes such as propidium monoazide (PMA) can intercalate with DNA from dead cell bacteria so that it cannot be amplified. Therefore, the objective of this study is to evaluate the use of propidium monoazide (PMAxx) associated with DNA sequencing to identify viable cells of Salmonella Thyphimurium, Staphylococcus aureus and Escherichia coli in whole UHT milk. UHT milk samples were contaminated with bacterial suspensions containing live cells, dead cells, and mixtures of 80% dead and 20% live cells, in concentrations ranging from 2 Log CFU/mL to 5 Log CFU/mL, treated and untreated with PMAxx and subsequent DNA sequencing. First, two lysis buffers were evaluated to determine the most suitable for this type of matrix, and the method using Neozol was the one with the most adequate results. Two concentrations of PMAxx were used and the results showed that the 50 μM concentration of PMAxx was more effective when compared to the 25 μM concentration in the treatment of samples contaminated with dead bacterial cell suspensions. Therefore, it was observed that the use of 50 μM PMAxx in samples with 2 Log CFU/mL of living cells of S. Thyphimurium and E. coli had cytotoxic effect, and for living cells of S. aureus this effect was most pronounced in cell concentrations from 2 Log CFU/mL to 4 CFU/mL. In the samples contaminated with mixture of live and dead cell, S. aureus was not sequenced at any concentration, E. coli only at Log 5 CFU/mL concentration and S. Thyphimurium was sequenced at all concentrations. However, higher concentrations of PMAxx would be required in dead S. Thyphimurium cells, as they had their DNA sequenced at all cell concentrations. Besides, DNA sequencing has proven to be a complete and efficient method for complex and high bacterial diversity samples such as milk From the results obtained it can be suggested that the treatment of samples with PMAxx for identification of viable bacteria in food through DNA sequencing is a promising method and should be further evaluated. Thus, it is suggested to evaluate and optimize PMAxx concentration, incubation time and light exposure, as well as application to different food matrices and pathogenic bacteria.