Quantificação de Listeria monocytogenes em filé de salmão (Salmo salar) pronto para o consumo por PMA-qPCR e sua sobrevivência durante a simulação gastrointestinal in vitro

Abstract

Considerando suas propriedades nutricionais, os produtos de pescado se tornaram uma escolha mais saudável, aumentando seu consumo no Brasil e no mundo. Em função disso, o hábito do consumo de peixe cru, com destaque especial ao Salmão do Atlântico (Salmo salar), tem se tornado cada dia mais comum. Isso, no entanto, pode trazer riscos à população, em função da possível persistência de importantes patógenos, como Listeria monocytogenes. A ampla capacidade de adaptação deste patógeno a ambientes desfavoráveis tem causado preocupação para órgãos fiscalizadores, indústrias e consumidores ao redor do mundo. Dessa forma, estudos sobre o comportamento de L. monocytogenes frente a desafios, como os presentes na passagem pelo trato gastrointestinal, podem ser determinantes na busca por soluções eficientes visando o seu controle. Além disso, métodos rápidos e confiáveis para a quantificação deste patógeno em produtos alimentares são essenciais. Assim, este estudo consistiu na quantificação de células viáveis de L. monocytogenes em amostras comerciais e artificialmente contaminadas de salmão pronto para o consumo, utilizando Propidio Monoazida (PMA) associado ao PCR quantitativo (PMA-qPCR). Foi possível observar neste estudo que o uso de PMA antes da extração de DNA para amplificação por qPCR pode ser uma alternativa promissora para quantificação de L. monocytogenes nestes alimentos. Isso porque esse protocolo reduz a replicação de DNA de células mortas, evitando falsos positivos, superando assim a maior limitação para o uso de qPCR em alimentos. Além disso, ao comparar os resultados do método PMA-qPCR com os obtidos através de um método de cultivo dependente, ficou claro que os métodos baseados em DNA são capazes de fornecer resultados mais rápidos e seguros. Esse fato pôde ser corroborado também através de uma análise do comportamento e da capacidade de adaptação da bactéria L. monocytogenes aos desafios encontrados ao longo de todo trato gastrointestinal humano, através de uma simulação in vitro destas condições. Neste estudo pode-se constatar a ocorrência da condição viável mas não cultivável (VBNC) após o stress causado pelo meio, sendo que o método de PMA-qPCR foi capaz de quantificar a bactéria mesmo onde a mesma não tinha capacidade de multiplicação através dos métodos cultivo dependentes.

Abstract: Due to their nutritional properties, fish products become a healthier food alternative, increasing their consumption in Brazil and worldwide. Therefore, the habit of eating raw fish, specially Atlantic Salmon (Salmo salar) has become usual. This, however, can represent a risk to the population, considering the possible persistence of important pathogens as Listeria monocytogenes. The adaptability of this pathogen to survive on hostile environments concerns regulatory agencies, industries and consumers around the world. Thus, investigation about the behavior of L. monocytogenes exposed to challenges, including those present in the passage through the gastrointestinal tract, can be crucial to find efficient solutions to control this problem. In addition, fast and reliable methods to quantify this pathogen in food products are essential. In this way, this study aimed of quantifying viable L. monocytogenes cells in commercial and artificially contaminated samples of ready-to-eat salmon using qPCR method associated to Propidio Monoazide (PMA) (PMA-qPCR). So, it was possible to observe that the use of PMA before DNA extraction for qPCR amplification can be a promising alternative for L. monocytogenes quantification in these foods. This protocol was able to reduce DNA replication of dead cells, avoiding false positives, overcoming the biggest limitation for the use of qPCR in foods. Furthermore, by comparing the results of the PMA-qPCR method with those obtained through a dependent culture method, it was clear that DNAbased methods lead to faster and safer results. This fact also was corroborated by an analysis of the behavior and adaptability of L. monocytogenes facing the challenges found throughout the human gastrointestinal tract, through an in vitro simulation of these conditions. In this study, it was possible to observe the occurrence of the viable but not cultivable condition (CNBV) after the stress caused by the environment, and the PMA-qPCR method was able to quantify L. monocytogenes even where it was not competente to multiply on the dependent culture methods.