Lactobacillus paracasei em iogurte artesanal: monitoramento da viabilidade celular e capacidade de biocontrole contra os principais microrganismos patógenos de origem alimentar

Abstract

Bactérias ácido láticas (BAL), como Lactobacillus paracasei, têm sido frequentemente adicionadas a diversas matrizes alimentares devido ao potencial probiótico, as propriedades antimicrobianas e as inúmeras características tecnológicas que apresentam. Alimentos fermentados, como iogurtes, têm sido usados como veículo para a incorporação de tais estirpes, pois proporcionam um bom ambiente para o crescimento e proliferação das bactérias. Produtos fermentados são geralmente considerados seguros, pois têm baixo pH e essa característica não favorece o crescimento de bactérias patogênicas de origem alimentar. No entanto, estudos recentes têm evidenciado a sobrevivência e a capacidade de proliferação de microrganismos patogênicos nesses ambientes. Neste contexto, o objetivo desse trabalho foi utilizar uma cepa de L. paracasei como potencial probiótico e agente de biocontrole em amostras de iogurte artesanal. Para isso, foi desenvolvido um ensaio molecular, baseado em PCR quantitativa (qPCR) combinado com monoazida de propídio (PMA), um corante intercalante de DNA, afim de diferenciar e quantificar as células viáveis de L. paracasei. Além disso, foram desenvolvidos iniciadores espécie-específicos para a detecção e quantificação de L. paracasei por qPCR e investigou-se a capacidade de biocontrole de L. paracasei contra microrganismos patogênicos de origem alimentar em amostras de iogurte artesanal. Primeiramente, L. paracasei foi cultivado em meio de cultura e submetido à tratamento térmico a 60 °C por diferentes períodos de tempo e iogurte contendo L. paracasei foi preparado e armazenado a 4 °C por 30 dias. As células viáveis foram quantificadas usando ensaios qPCR e PMA-qPCR tendo como alvo o gene tuf e também por contagem em placa. Curvas padrões foram preparadas e a eficiência média obtida foi de 94 % e 96 % (R2 > 0.98) para L. paracasei em meio de cultura e iogurte armazenado por um dia, respectivamente. O limite de detecção (LOD) para ambas as amostras foi de 104 cópias do genoma, correspondendo a 32.1 pg de DNA. Os resultados de contagem obtidos para L. paracasei tratado termicamente foram concordantes pelos métodos PMA-qPCR e contagem em placa. O valor de UFC reduziu conforme o tempo do tratamento térmico aumentou, enquanto a contagem por qPCR se manteve constante. A enumeração de L. paracasei obtida por qPCR para iogurte suplementado com a cepa potencialmente probiótica armazenado por um dia e 30 dias foram maiores do que a enumeração por PMA-qPCR para as mesmas amostras. Os valores de contagem em placa foram similares aos valores de UFC obtidos por PMA-qPCR. Com relação aos iniciadores espécieespecíficos, sete pares com diferentes regiões como alvo foram sintetizados. Os pares de iniciadores Lsei1 e Lsei2, cujo alvo é o gene responsável pelo sistema manose/frutose/acetil-galactosamina mostraram resultados satisfatórios, amplificando amostras positivas com Cq médio de 17,43 e 20,83 para cada iniciador, respectivamente. Diferentes estirpes de BAL, incluindo L. paracasei e microrganismos patogênicos foram cultivados em caldo MRS e BHI a 37 °C por 24hs, respectivamente. Os microrganismos foram inoculados em placas de 24 poços em concentrações pré-determinadas, afim de avaliar a capacidade das estirpes em sobreviverem e multiplicarem-se sob condições ácidas e de armazenamento a frio. Em condições ácidas (pH 4,0 e 4,5), observou-se que todos os patogênicos e as BAL foram capazes de sobreviver por até 6 horas. Quando a condição ácida e o armazenamento a frio foram aplicados simultaneamente, foi observado um aumento na contagem bacteriana de todos os microrganismos, demonstrando que a combinação de ambas as condições pode favorecer a multiplicação dos mesmos. Para avaliar a atividade antimicrobiana de 5 estirpes de BAL, dois métodos foram utilizados: ensaio de ágar spot e ensaio de difusão em poço. Dentre as BAL avaliadas, L. paracasei subsp. paracasei foi a que apresentou o melhor efeito antagônico contra todas as estirpes de patógenos testados. Por isso, essa estirpe foi adicionada à amostra de iogurte artesanal, afim de avaliar a capacidade da estirpe L. paracasei em atuar como potencial probiótico e agente de biocontrole. As amostras de iogurte foram pós-contaminadas com 3 diferentes microrganismos patogênicos e armazenadas a 7 e 12 °C. L. paracasei subsp. paracasei mostrou ser capaz de reduzir a contagem dos 3 patogênicos em níveis consideráveis. Estes estudos mostram que L. paracasei e seus compostos extracelulares podem representar uma estratégia eficiente para prevenir surtos de origem alimentar em produtos artesanais, além de demonstrar que abordagens moleculares tem oferecido resultados precisos, confiáveis e mais rápidos quando comparados aos métodos clássicos da microbiologia para a quantificação de células viáveis em alimentos.

Abstract: Lactic acid bacteria (BAL), such as Lactobacillus paracasei, have been frequently added to diverse food matrices due to their probiotic potential, their antimicrobial properties and the numerous technological characteristics they present. Fermented foods, such as yogurt, have been used as a vehicle for incorporating such strains, as they provide a good environment for the growth and proliferation of bacteria. Fermented products are generally considered safe, they have low pH and this characteristic does not favor the growth of foodborne pathogenic bacteria. However, recent studies have shown the survival and the ability of pathogens to proliferate in these environments. In this context, the main objective of this work was to use the bacterium L. paracasei as a probiotic microorganism and biocontrol agent in samples of artisanal yogurt. For this, a molecular assay was developed, based on quantitative PCR (PCR) combined with propidium monoazide, an intercalating DNA dye, in order to differentiate and quantify viable L. paracasei cells. In addition, species-specific primers were developed for the detection and quantification of L. paracasei by qPCR and the biocontrol capacity of L. paracasei against foodborne pathogenic microorganisms in artisanal yogurt samples was investigated. First, L. paracasei was grown in culture medium and subjected to heat treatment at 60 ° C for different periods of time and probiotic yogurt containing L. paracasei was prepared and stored at 4 ° C for 30 days. Viable cells were quantified using qPCR and PMA-qPCR assays targeting the tuf gene and also by plaque counting. Standard curves were prepared and the average efficiency obtained was 94% and 96% (R2> 0.98) for L. paracasei in culture medium and probiotic yogurt stored for one day, respectively. The detection limit (LOD) for both samples was 104 copies of the genome, corresponding to 32.1 pg of DNA. The counting results obtained for thermally treated L. paracasei were consistent with the PMA-qPCR and plate counting methods. The CFU value decreased as the heat treatment time increased, while the qPCR count remained constant. The enumeration of L. paracasei obtained by qPCR for probiotic yogurt stored for one day and 30 days was greater than the enumeration by PMA-qPCR for the same samples. The plate count values were similar to the CFU values obtained by PMA-qPCR. Regarding species-specific primers, seven pairs with different target regions were synthesized. The pairs of primers Lsei1 and Lsei2, whose target is the gene responsible for the mannose / fructose / acetyl-galactosamine system, showed satisfactory results, amplifying positive samples with an average Cq of 17.43 and 20.83 for each primer, respectively. Different strains of BAL, including L. paracasei and pathogenic microorganisms were grown in MRS and BHI broth at 37 ° C for 24 hours, respectively. The microorganisms were inoculated in 24-well plates at predetermined concentrations, in order to evaluate the ability of the strains to survive and multiply under acidic conditions and cold storage. Under acidic conditions (pH 4.0 and 4.5), it was observed that all pathogens and BAL were able to survive for up to 6 hours. When the acidic condition and cold storage were applied simultaneously, an increase in the bacterial count of all microorganisms was observed, demonstrating that the combination of both conditions can favor their multiplication. To evaluate the antimicrobial activity of 5 BAL strains, two methods were used: spot agar assay and well diffusion assay. Among the BAL evaluated, L. paracasei subsp. paracasei showed the best antagonistic effect against all strains of pathogens tested. Therefore, this strain was added to the artisanal yogurt sample, in order to assess the ability of L. paracasei strain to act as a probiotic and biocontrol agent. The yogurt samples were post-contaminated with 3 different pathogens and stored at 7 and 12 ° C. L. paracasei subsp. paracasei has been shown to be able to reduce the count of the 3 pathogens to considerable levels. These studies show that L. paracasei and its extracellular compounds can represent an efficient strategy to prevent food-borne outbreaks in artisanal products, in addition to demonstrating that molecular approaches have offered accurate, reliable and faster results when compared to classic microbiology methods for quantification of viable cells in food.