Palitoxinas como potenciais agentes etiológicos da doença de Haff: otimização e validação de um método analítico empregando LC-ESI-MS/MS para a investigação de amostras de pescado diretamente associadas à doença no Brasil

Abstract

A doença de Haff, também conhecida como doença da urina preta, é tipicamente desenvolvida após a ingestão de pescado contaminado e tem como principais achados clínicos a rabdomiólise e a mioglobinúria. No Brasil, casos confirmados da doença foram descritos apenas a partir de 2008 nas regiões Norte e Nordeste e, desde então, sua incidência e distribuição tem aumentado. Além da preocupação relacionada à segurança de alimentos, o receio da população quanto ao consumo de pescado nas regiões mais afetadas ainda têm proporcionado elevados prejuízos à cadeia produtiva local. Ademais, a etiologia da doença ainda é desconhecida, mas estudos recentes tem sugerido sua possível relação com as palitoxinas. Sendo assim, o objetivo do presente trabalho foi otimizar e validar um método analítico previamente desenvolvido para detecção de produtos de oxidação de palitoxinas, empregando LC-ESI-MS/MS, a fim de investigar a sua presença em amostras de pescado diretamente associadas ao desencadeamento da doença de Haff no Brasil. A otimização do método foi realizada por meio de um delineamento composto central rotacional utilizando amostras de peixe de água doce (tambaqui) fortificadas com padrão analítico de palitoxina. Em seguida, o método otimizado foi submetido a um processo de validação intralaboratorial de acordo com o Regulamento de Execução 2021/808/EC, com algumas adaptações, em virtude da complexidade e das limitações ainda enfrentadas na análise de palitoxinas. O preparo de amostras envolveu uma extração sólido-líquido seguida de uma extração em fase sólida que inclui a reação das palitoxinas com ácido periódico. A detecção dosprincipais fragmentos oxidados obtidos por esta reação (fragmentos amida e amina) foi realizada por LC-ESI-MS/MS no modo positivo, utilizando coluna C18, e contendo acetonitrila e água como fases móveis, ambas acidificadas com 0,1% de ácido fórmico. Após a otimização e validação do método, a investigação etiológica foi executada com a análise de 16 amostras de pescado (pescado in natura e sobra de refeições à base de pescado) associadas ao desencadeamento da doença de Haff no Brasil, coletadas a partir dos episódios ocorridos em 2022. Ao final, foi possível observar que o resultado obtido na otimização do método foi satisfatório e resultou em um aumento de sinal de aproximadamente 20% para os analitos. Ademais, mesmo com as limitações ainda existentes na validação de métodos envolvendo a análise de palitoxinas, o processo de validação executado no presente projeto é um dos mais completos já publicados. O método demonstrou ser apropriado para análises quantitativas em amostras de pescado (peixes de água doce e salgada, crustáceos e moluscos bivalves) e apresentou elevada sensibilidade (LQ de 10 µg kg?¹), sendo capaz de trabalhar em uma faixa que inclui o limite provisório de ingestão de palitoxinas (30 µg kg?¹). Se tratando da investigação etiológica, com os resultados obtidos, ainda não é possível assumir que há uma relação entre as palitoxinas e o desencadeamento da doença de Haff no Brasil. Para futuros estudos, recomenda-se a realização de uma análise confirmatória empregando espectrometria de massas de alta resolução.

Abstract: Haff disease, also known as black urine disease, is typically developed after ingestion of contaminated marine and seawater species and its main clinical findings are rhabdomyolysis and myoglobinuria. In Brazil, confirmed cases have been described only since 2008 in North and Northeast regions and, since then, its incidence and distribution has increased. In addition to the concern related to food safety, the populations? fear regarding the consumption of fish in the most affected regions has caused high losses to the local production chain. Moreover, the causative agent of the disease is still unknown, but recent studies have suggested its possible correlation with palytoxins. Therefore, the objective of the present work was to optimize and validate an analytical method previously developed for the detection of palytoxin oxidation products, using LC-ESI-MS/MS, to investigate the presence of these biotoxins in food samples directly associated with Haff disease in Brazil. The optimization of the method was carried out through a rotatable central composite design using samples of freshwater fish (tambaqui) fortified with a palytoxin analytical standard. Then, the optimized method was subjected to an intralaboratory validation process in accordance with the European guideline 2021/808/EC, with some adaptations, due to the complexity and limitations still faced with palytoxins analysis. Sample preparation involved a solid-liquid extraction followed by a solid phase extraction that includes the reaction of palytoxins with periodic acid. The detection of the main oxidized fragments obtained by this reaction (amide and amine fragments) was carried out by LC-ESI-MS/MS in positive mode, using a C18 column, and containing acetonitrile and water as mobile phases, both acidified with 0.1% of formic acid. After the method optimization and validation, the etiological investigation was carried out with the analysis of 16 marine and freshwater food samples (in natura and leftover meals) associated with Haff disease in Brazil, collected from the episodes that occurred in 2022. Finally, it was possible to observe that the result obtained in the method optimization was satisfactory and resulted in a signal increase of approximately 20% for the analytes. Furthermore, even with the limitations that still exist for method validations involving palytoxins analysis, the validation process carried out in the present project is one of the most complete published so far. The method demonstrated to be appropriate for quantitative analyzes of marine and freshwater samples (marine and freshwater fish, crustaceans and bivalve mollusks) and presented high sensitivity (LQ of 10 µg kg?¹), being able to work in a range that includes the provisional palytoxin intake limit (30 µg kg?¹). Regarding the etiological investigation, with the results obtained, it is still not possible to assume that there is a relationship between palytoxins and the Haff disease triggering in Brazil. For future studies, a confirmatory analysis using high-resolution mass spectrometry is recommended.