Avaliação toxicológica do extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10.

Abstract

Alguns microrganismos possuem a capacidade de produzir substâncias que podem influenciar no desenvolvimento de outros microrganismos. Desde os anos 50 é relatada a capacidade de várias espécies de bactérias do gênero Bacillus de produzir substâncias com atividade antimicrobiana como peptídeos, também denominados de bacteriocinas e enzimas como a subtilisina, subtilina, as proteases e as termolisinas. Muitos desses peptídeos e enzimas têm sido caracterizados bioquimicamente e geneticamente. Embora sejam conhecidas, a função estrutural, a biossíntese e modo de ação de alguns peptídeos antimicrobianos e enzimas, muitos aspectos desses compostos ainda permanecem desconhecidos. Frente a essa realidade, o presente estudo investigou a atividade antibacteriana e antifúngica e a toxicidade in vitro e in vivo do extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens R 10. O extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 foi obtido por técnicas de precipitação de proteínas, centrifugação, diálise e esterilização por filtração. A padronização das análises toxicológicas e de atividade antibacteriana e antifúngica foi realizada pela determinação da concentração de proteínas do extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens R 10. O ensaio de atividade antibacteriana e antifúngica foi realizado pela técnica de difusão em poços. Dentre os diferentes indicadores utilizaram-se bactérias Gram-positivas (Listeria monocytogenes NCTC 098630, Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Enterococcus faecalis ATCC 29212), Gram-negativas (Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Enterobacter aerogenes ATCC 13048 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027), fungos (Aspergillus fumigatus ATCC 9197 e Penicillium commune J 238) e leveduras (Rhodotorula muscilaginosa J 350, Pichia anomala DSM 70255 e Kluveromyces marxianus ATCC 16045). O extrato bruto foi testado nas concentrações de 5, 20, 40, 60 e 80 g de proteínas, em ambos os ensaios de atividade antimicrobiana. Para avaliar a toxicidade do extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 foram utilizados ensaios in vitro (genotoxicidade) e in vivo (toxicidade aguda em ratos e camundongos e toxicidade de doses repetidas em camundongos). A investigação da genotoxicidade com células VERO ATCC-CCL 81 foi realizada pelo ensaio Cometa, utilizando-se 60, 80 e 100 g de proteínas do extrato bruto. Para análise toxicológica aguda em ratos Wistar (Rattus norvegicus), utilizou-se um grupo de 10 animais (5 machos e 5 fêmeas) tratado com o extrato bruto, por gavagem oral, com a dose de 2.000µg/kg (dose máxima recomendada). Os animais foram pesados no início e no final do experimento e observados por 14 dias quanto aos possíveis sinais de toxicidade (morte, coma, convulsão, prostração, ataxia, tremores, alteração na pele ou pêlo, alteração nas mucosas, diarréia e salivação). Para análise toxicológica aguda em camundongos Swiss (Mus musculus), utilizou-se o extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 por gavagem oral, numa única administração, nas doses de 5, 50, 500 e 5.000 g/kg a 80 camundongos (40 machos e 40 fêmeas, contendo 10 animais por grupo). Outros 20 camundongos (10 machos e 10 fêmeas) receberam veículo (salina, NaCl 0,9%), pela mesma via. Para análise toxicológica de doses repetidas em camundongos Swiss (Mus musculus) utilizou-se o extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 administrado por gavagem oral, por um período de 90 dias nas doses de 50, 500 e 5.000 g/kg em 120 animais (60 machos e 60 fêmeas, contendo 20 animais por grupo). Outros 40 camundongos (20 machos e 20 fêmeas) receberam veículo (salina, NaCl 0,9%), pela mesma via. Constatou-se nos ensaios de atividade antimicrobiana que o extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens R 10 não apresentou atividade contra os bolores e as leveduras nas concentrações testadas, e somente apresentou atividade antibacteriana frente Listeria monocytogenes NCTC 098630. O extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 não foi genotóxico para células VERO na concentração de 60µg/ml, porém apresentou genotoxicidade nas concentrações de 80 e 100µg/ml. Na análise toxicológica aguda em ratos a dose letal 50 (DL50) foi superior a 2.000µg/kg. Na análise toxicológica aguda em camundongos, o extrato bruto apresentou boa tolerabilidade e reduzidos efeitos tóxicos agudos importantes, com DL50 superior a 5.000µg/kg. Já na análise toxicológica de doses repetidas, a non toxic adverse effect level (NOAEL) para o extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 situa-se entre as doses de 50 e 500 g/kg. Os resultados indicam que o extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 apresenta um grande potencial como conservador natural de alimentos, dada sua marcante atividade antilisterial e sua relativa segurança toxicológica. Some microorganisms are able to produce substances that can influence the growth of other microorganisms. The ability of various bacterial species of the genus Bacillus to produce substances with antimicrobial activity such as peptides, also called bacteriocins, and enzymes such as subtilisin, subtilin, proteases and thermolysins has been reported since the 1950's. Many of these peptides and enzymes have been characterized biochemically and genetically. Although the structural function, biosynthesis and mode of action of some antimicrobial peptides and enzymes have been identified, many aspects of these compounds are still unknown. The present study investigated the antibacterial and antifungal activity and the in vitro and in vivo toxicity of the crude extract of Bacillus amyloliquefaciens R 10. The antibacterial crude extract of Bacillus amyloliquefaciens R 10 was obtained by techniques of protein precipitation, centrifugation, dialysis and sterilization through filtration. The standardization of the toxicological analysis, and antibacterial and antifungal activity was realized by determining the concentration of proteins in the crude extract of Bacillus amyloliquefaciens R 10. The assay of antibacterial and antifungal activity was done by agar diffusion technique in wells. Among the different indicators were used the Gram-positive bacteria (Listeria monocytogenes NCTC 098630, Staphylococcus aureus ATCC 25923 and Enterococcus faecalis ATCC 29212), Gram-negative (Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Enterobacter aerogenes ATCC 13048 and Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027), molds (Aspergillus fumigatus ATCC 9197 and Penicillium commune J 238), and yeasts (Rhodotorula muscilaginosa J 350, Pichia anomala DSM 70255 and Kluveromyces marxianus ATCC 16045). The crude extract was tested in concentrations of 5, 20, 40, 60 and 80 g of protein in both assays of antimicrobial activity. To evaluate the Bacillus amyloliquefaciens R 10 antibacterial crude extract's toxicity were used in vitro (genotoxicity) and in vivo (acute toxicity in rats and mice and repeated doses toxicity in mice) assays. The research of the genotoxicity with VERO ATCC-CCL 81 cells was made by Comet assay, using 60, 80 e 100 g of protein of the crude extract. To the acute toxicological analysis in rats Wistar (Rattus norvegicus), were used one group with 10 animals (5 males and 5 females) treated with the crude extract by oral gavage, with dose of 2,000µg/kg (maximum dose recommended). The animals were weighed at the beginning and at the end of the experiment, and observed during 14 days as the possible toxicity signs (death, coma, convulsions, prostration, ataxy, tremors, skin or hair alterations, mucous alteration, diarrhea and salivation). To the acute toxicological analysis in Swiss mice (Mus musculus), the antibacterial crude extract of Bacillus amyloliquefaciens R 10 was used by oral gavage, in a single administration, in doses of 5, 50, 500 and 5,000 g/kg to 80 mice (40 males and 40 females, with 10 animals per group). Other 20 mices (10 males and 10 females) received the vehicle (saline, NaCl 0.9%), through the same route. To the repeated doses toxicological analysis in Swiss mice (Mus musculus) the antibacterial crude extract of Bacillus amyloliquefaciens R 10 was administrated by oral gavage during 90 days in doses of 50, 500 and 5,000 g/kg in 120 animals (60 males and 60 females, in groups of 20 animals). Other 40 mice (20 males and 20 females) received the vehicle (saline, NaCl 0.9%), through the same route. It was verified in the antimicrobial activity assays that the crude extract of Bacillus amyloliquefaciens R 10 didn't present activity against molds and yeasts in the tested concentrations, and only presented antibacterial activity against Listeria monocytogenes NCTC 098630. The antibacterial crude extract of Bacillus amyloliquefaciens R 10 was not genotoxic to VERO cells at concentration of 60µg/ml, but showed genotoxicity at concentration of 80 and 100µg/ml. In the acute toxicological analysis in rats the letal dose 50 (DL50) was higher than 2,000µg/kg. In the acute toxicological analysis in mice, the crude extract presented good tolerability and litle important acute toxic effects with DL50 higher than 5,000µg/kg. In the repeated doses toxicological analysis, a non toxic adverse effect level (NOAEL) for the antibacterial crude extract is between the doses of 50 and 500 g/kg. The results showed that the antibacterial crude extract of Bacillus amyloliquefaciens R 10 presents a great potential as a natural food preservative, due to its notable antilisterial activity, and its relative toxicological security.