Desenvolvimento e validação de método multirresíduo para determinação de resíduos de antimicrobianos em leite por CLAE-FL/DAD e CLAE-MS/MS

Abstract

Antimicrobianos são extensivamente empregados na medicina veterinária para prevenção e tratamento de infecções em animais produtores de alimentos. O uso disseminado desses fármacos na prática leiteira acarreta a presença de seus resíduos no leite. Resíduos de antimicrobianos representam riscos à saúde do consumidor, podendo causar reações de hipersensibilidade e resistência microbiana. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar método multirresíduo para análise de resíduos de sulfonamidas, fluorquinolonas e ceftiofur em leite, empregando a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por fluorescência, arranjo de diodos e espectrometria de massas. Diferentes etapas foram avaliadas quanto à extração dos antimicrobianos em leite, sendo empregadas extrações líquido-líquido e em fase sólida. O método quantitativo foi avaliado quanto aos critérios de desempenho: seletividade, linearidade e faixa de trabalho, sensibilidade, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação, limite de decisão (CC?), capacidade de detecção (CC?) e robustez, para validação analítica segundo a Diretiva 657/2002 da Comunidade Européia. Adicionalmente, a identidade dos compostos foi confirmada por cromatografia líquida com detecção por espectrometria de massas, a partir de extração líquido-líquido em leite. De modo a avaliar o desempenho dos métodos, diferentes amostras de leite obtidas comercialmente foram analisadas pelos métodos quantitativo e confirmatório. A extração líquido-líquido com água 10% ácido tricloroacético demonstrou melhor resultado para extração dos resíduos em leite, em comparação à extração em fase sólida. O gradiente de eluição permitiu a separação cromatográfica de onze antimicrobianos, compreendo quatro fluorquinolonas (ciprofloxacino, norfloxacino, danofloxacino e enrofloxacino), seis sulfonamidas (sulfatiazol, sulfaclorpiridazina, sulfametoxazol, sulfamerazina, sulfadoxina e sulfadimetoxina) e uma cefalosporina (ceftiofur). O método foi validado em conformidade com a Legislação Européia com desempenho analítico adequado. Os coeficientes de correlação (r2) foram superiores a 0,98 para todas as curvas, com recuperações superiores a 98% para todos os analitos e limites de detecção e quantificação abaixo dos valores de limite máximo permitido para os compostos em leite. A repetibilidade e a reprodutibilidade foram inferiores ou iguais a 7,40% e 10,13%, respectivamente. Nas amostras de leite não houve detecção para os antimicrobianos. Os métodos desenvolvidos representam alternativa eficiente para análise multirresíduo em leite, com aplicabilidade confirmada pela análise de amostras reais de leite de diferentes origens.

Antimicrobials are extensively used in veterinary medicine for prevention and treatment of infections in food-producing animals. The widespread use of these drugs in dairy practice leads to the presence of its residues in milk. Antimicrobial residues can pose risks to consumers health, may causing hypersensitivity reactions and microbial resistance. The objective of this work was to develop and validate multiresidue method for the analysis of sulfonamide, fluoroquinolone, and ceftiofur residues in milk, using high performance liquid chromatography with fluorescence, diode array and mass spectrometry detections. Different steps were evaluated for extracting antimicrobials in milk, by applying liquid-liquid and solid phase extractions. The quantitative method was evaluated regarding performance criteria: selectivity, linearity and working range, sensitivity, precision, accuracy, detection limit, quantification limit, decision limit (CC?), detection capability (CC?) and robustness, for analytical validation according to Directive 657/2002 of the European Community. Additionally, the analytes identities were confirmed by liquid chromatography with mass spectrometry detection, through a liquid-liquid extraction in milk. To evaluate methods performance, different milk samples obtained at local markets were analyzed by both quantitative and confirmatory methods. The liquid-liquid extraction with 10% trichloroacetic acid in water showed better results for residue extraction in milk compared to solid phase extraction. The elution gradient allowed the chromatographic separation of eleven antimicrobials, comprising four fluoroquinolones (ciprofloxacin, norfloxacin, danofloxacin and enrofloxacin), six sulfonamides (sulfathiazole, sulfachlorpyridazine, sulfamethoxazole, sulfamerazine, sulfadoxine and sulfadimethoxine) and one cephalosporin (ceftiofur). The quantitative method was validated in line with European requirements with adequate analytical performance. The correlation coefficients (r2) were greater than 0.98 for all curves, also the recoveries rates were above 98% for all analytes and the LOD and LOQ limits were lower than the maximum permitted limit for the compounds in milk. The intra-day and inter-day precisions were below or equal to 7.40% and 10.13%, respectively. Milk samples showed no detection for the antimicrobials. The developed methods comprise an efficient alternative to multiresidue analysis in milk, with applicability confirmed by analysis of real milk samples from different origins.